Abstract

Copper-containig enzyme, laccase (Rhus vernicifera) was immobilized onto gold electrode using self-assembly technique and its surface properties and catalytic activities were examined. Laccase is an oxidoreductase capable to oxidize diphenols or diamines by 4-electron reduction of molecular oxygen without superoxide or peroxide intermediates. The electrode surface were modified by $\beta-mercaptopropionate$ to have a net negative charge in neutral solution and positively charged laccase (pI=9) was immobilized by electrostatic interaction. The successful immobilization was confirmed by cyclic voltammograms which showed typical surface-confined shapes and behaviors. The amount of charge to reduce the surface was similar to the charge calculated assuming the surface being covered by monolayer. The activity of the immobilized enzyme was tested by the capbility of oxidizing a substrate, ABTS (2,2-azine-bis-(3-ethylbenzthioline-6-sulfonic acid) and it was maintained for $2\~3$ days at $4^{\circ}C$. The immobilzed laccase showed about $10\~15\%$ activity compared to that in solution. The laccase-modified electrode showed the activity of elefoocatalytic reduction of oxygen in the presence of mediator, $Fe(CN)_6^{3-}$ The addtion of azide which is an inhibitor of laccase compeletly eliminated the catalytic current.

구리이온을 함유하는 효소인 laccase(Rhus vernicifera)를 self-assembly technique을 이용하여 금전극 표면에 고정시킨 후 표면의 특성을 관찰하고 반응을 살펴보았다. laccase는 diphenol, diamine등을 산소에 의해 산화시킬 수 있는 oxidoreductase이다. 이 경우 산소는 peroxide나 superoxide 등의 중간체 생성없이 물까지 직접 4전자 환원이 일어난다. $\beta-mercaptopropionate$를 이용하여 금전극 표면에 음전하를 띤 self-assembled monolayer를 형성시킨 후, 중성용액에서 양 전하를 띤 laccase(pI=9)를 정전기적 인력에 의해 고정시킨 후, 순환 전압-전류법에 의한 실험으로 전극표면에 고정되었음을 확인하였다. 또한, 낮은 주사속도에서 흐른 전하량으로부터 surface coverage를 계산하여 전극표면에 효소가 monolayer로 덮여 있음을 확인하였다. laccase가 고정된 전극을 laccase의 기질인 ABTS(2,2-azino-bis-(3-ethylbenzthioline-6-sulfonic acid) 용액에 담그면 ABTS가 산화되는 것으로부터 고정된 laccase가 활성을 가지고 있음을 확인하였고, 그 효소효과는 $4^{\circ}C$에서 $2\~3$일 동안 지속됨을 관찰하였다. 앞서 구한 surface coverage로부터 고정된 효소의 양을 알 수 있어서, 표면에 고정된 laccase가용액상의 laccase에 비하여 $10\~15\%$정도만의 효소효과를 유지하고 있음을 알 수 있었다. 또한, laccase의 산소의 전기화학적 환원 촉매로서의 역할에 대하여 용액상에서와 전극표면에 고정시켰을 경우에 비교하여 보았는데, 두 경우 다 전자전달체가 없이는 산소환원의 촉매로 작용하지 않고, $Fe(CN)_6^{3-}$를 전자전달체로 사용한 경우에 산소환원의 촉매로 작용함을 알 수 있었다. 이러한 산소환원촉매로서의 역할이 laccase로부터 기인한다는 것은 억제제인 azide를 이용한 실험으로 다시 한 번 확인할 수 있었다.

Keywords

• Laccase;
• Catalysis;
• Oxygen;
• Immobilization;
• Self-assembly