Abstract
Background: K-cells function as targets for insulin gene therapy. In a previous study, we constructed EBV-based plasmids expressing rat preproinsulin controlled by glucose-dependent insulinotropic polypeptide promoters. In the present study, we attempted to correct hyperglycemia in vivo using genetically engineered K-cells in a mouse model of type 1 diabetes. Methods: K-cells expressing insulin were transplanted under the kidney capsules of STZ-induced diabetic mice. The blood glucose levels and body weights of the experimental animals were measured daily. After four weeks, the mice were injected intra-peritoneally with 2 g/kg glucose following a 6 hr fast. Blood glucose levels were measured immediately following glucose injections. All animals were sacrificed at the end of the glucose tolerance study, and pancreas and graft-bearing kidney tissue samples were stained with antibodies against insulin, glucagon, and C-peptide. Results: The body weights of K-cell-transplanted diabetic mice increased after transplantation, whereas those of untreated diabetic control mice continued to decline. The blood glucose levels of K-cell-transplanted diabetic mice decreased gradually during the two weeks following transplantation. After intra-peritoneal injection of glucose into K-cell-transplanted diabetic mice, blood glucose levels increased at 30 minutes, and were restored to the normal range between 60 and 90 minutes, while untreated control diabetic mice continued to experience hyperglycemia. Kidney capsules containing transplanted K-cells were removed, and sections were stained with anti-insulin antibodies. We detected insulin-positive cells in the kidney capsules of K-cell-transplanted diabetic mice, but not in untreated control mice. Conclusion: We detected glucose-dependent insulin secretion in genetically engineered K-cells in a mouse model of type 1 diabetes. Our results suggest that genetically modified insulin producing K-cells may act as surrogate $\beta$-cells to effectively treat type 1 diabetes.
연구배경: 인슐린 유전자 치료법의 이상적인 표적세포로 K-세포가 알려져 있다. 이전 연구에서 본 연구자들은 EBV- 유래 에피솜 벡터를 이용하여 K-세포에서 포도당농도 의존적인 인슐린 분비가 이루어지는 것을 실험실 환경에서 확인한 바 있다. 본 연구에서는 스트렙토조토신(STZ)으로 유발된 제1형 당뇨병 쥐의 신장 피막에 유전공학적으로 제조된 K-세포를 이식하여 당뇨병이 치료되는지를 관찰해 보았다. 방법: 인슐린이 분비되도록 제조된 K-세포를 STZ으로 유도된 BALB/c Nude 마우스의 신장 피막에 이식한 후 혈당과 몸무게를 측정하였다. 마우스는 정상군과 STZ으로 유도된 당뇨병군 그리고 당뇨병군의 일부는 K-세포를 이식한 치료군 등으로 분류하여 실험을 하였다. 이식 4주 후 모든 마우스에서 6시간 동안 금식한 후 2 g/kg의 포도당을 복강 내로 주사하여 당내성검사를 하였다. 당내성검사가 끝나자마자 모든 마우스의 신장과 췌장을 적출하여 인슐린, 글루카곤, C-peptide 등으로 면역조직화학염색 및 면역형광염색을 한 후 그 결과를 분석하였다. 결과: STZ을 복강에 주사한 마우스는 주사 3일 후 혈당이 300 ${\pm}$ 50 mg/dL로 상승하였다. 정상군과 K-세포를 이식한 당뇨병군에서는 몸무게가 점차 증가하였으나, STZ만을 주사한 당뇨병군에서는 실험기간 동안 낮게 유지되었다. 그리고 정상군에서는 정상범위의 혈당분포를 유지하였으나, STZ만을 주사한 당뇨병군에서는 지속적으로 혈당이 높게 유지되었다. 그리고 K-세포를 이식한 당뇨병군에서는 STZ만을 주사한 군에서보다 혈당이 서서히 떨어졌으며 이식 2주 후부터는 급격히 감소하였다. 당부하검사 결과 정상군과 K-세포를 이식한 당뇨병군에서는 서로 유사한 내당력을 보였으나 STZ만을 주사한 군에서는 지속적으로 포도당 불내성을 보였다. 조직면역검사 결과 정상군의 췌장에서는 인슐린과 글루카곤, C-peptide 모두에 염색이 되었지만 STZ만을 주사한 마우스의 췌장에서는 췌도파괴로 인슐린은 물론 글루카곤, C-peptide 모두에 염색이 되지 않았다. 그러나, K-세포를 이식한 당뇨병군의 신장에서는 면역조직화학염색에서 인슐린과 C-peptide 모두에서 염색이 되었으며 면역형 광염색에서도 인슐린이 발현하는 것을 관찰할 수 있었다. 결론: 유전공학적으로 제조된 K-세포가 마우스 신장 피막에 착상되어 혈당농도 의존적으로 인슐린을 분비하여 당뇨병이 치료되는 것을 생체 내에서도 확인할 수 있었으며, EBV-유래 에피솜벡터를 이용한 유전공학적 조제 K-세포는 제1형 당뇨병의 치료를 위한 대체베타세포로 사용될 수 있을 것으로 생각된다.