Abstract
Cryopreservation is accompanied by rapid temperature changes. Boar spermatozoa are containing the high content of unsaturated fatty acids. For that reason, boar sperm sensitive to oxidative stress causes during frozen-thawing compare with another species. Thus antioxidant is essential substance of freezing buffer, we utilize curcumin for antioxidant of freezing buffer. Curcumin have been proven to be effective, is widely known now. The purpose of this study to determine the effects of curcumin added to freezing buffer on semen parameters, Lipid peroxidation (LPO) which is caused by reactive oxygen species (ROS) in sperm membrane and total sperm oxidation stress after post-thawing of boar sperm. Semen parameter is measured using CASA and determine ROS rate, oxidative stress of boar sperm using FACS. Boar semen samples diluted with freezing buffer containing curcumin (0, 10, 50, 100 and $500{\mu}M$) was cooled to $4^{\circ}C$ and frozen in 0.5 mL straws that post-thawing were evaluated. As a result, we found that curcumin could protect the sperm plasma membrane from free radical and LPO during boar sperm postthawing. While no additive (control) sample was showed motility $49.8{\pm}4%$ and progressive motility $33.4{\pm}2$%, curcumin ($10{\mu}M$) sample showed significant increases in motility $50.4{\pm}2.9$%, progressive motility $31.7{\pm}4$% (P<0.05). These results indicate that supplementing with curcumin ($10{\mu}M$) during post-thawing sperm capacity preserve from oxidative stress and induce LPO of sperm membrane.
동결보존 기술은 효용성이 높은 기술이나 급격한 온도변화를 동반하기 때문에 기술을 활용하는데 있어 그 사용이 제한적이다. 돼지 정자는 다른 축종에 비하여 세포막에 불포화 지방산이 높은 비율로 함유되어 있다. 이는 돼지 정자가 저온충격을 받기 쉽고, 세포막에 지질 과산화가 발생할 확률이 다른 축종에 비해 높다는 것을 시사한다. 이러한 이유로 돼지정자의 동결보존 실험에 있어 동결보존액에 항산화 물질을 첨가하는 것은 필수적이다. 우리는 선행연구를 통해 항산화 효과가 입증되었으나 동결보존 실험에서 활용되지 않았던 curcumin을 항산화 물질로 이용하였다. 본 실험에 목적은 동결보존액에 첨가한 curcumin이 돼지 정자의 동결-융해과정에서 발생하는 ROS와 산화 스트레스로부터 정자의 운동성과 세포막의 지질 과산화의 발생을 억제하는데 어느 정도의 효과가 있는지 입증하는 것이다. 돼지 정자의 운동성과 움직임에 대한 분석은 CASA를 이용하였으며, 산화 스트레스와 정자내 ROS의 비율은 FACS로 측정하였다. Curcumin (0, 10, 50, 100, and $500{\mu}M$)은 각 농도 별로 동결보존액에 첨가되었으며, 돼지 정자는 동결 전처리 과정에서 온도를 $4^{\circ}C$까지 낮춘다. 그 다음 0.5 mL straw에 돼지 정자를 주입하고 액체질소에 침지하여 동결하였다. 그 후 최소 2주일 이상 지난 다음 동결한 시료를 융해하여 평가하였다. 그 결과 curcumin이 동결-융해과정 동안 발생하는 산화 스트레스로부터 돼지 정자를 보호하는 역할을 한다는 것을 입증하였다. CASA를 이용하여 분석한 정자의 운동성의 경우, 대조군은 움직임을 보이는 정자의 비율이$49.8{\pm}4%$, 그 중 직진 운동을 보인 정자의 비율이$33.4{\pm}2%$을 나타낸 것에 비하여 curcumin을 첨가한 모든 실험군은 대조군과 비교했을 때 유의적으로 높은 수치를 보였다. 특히 curcumin을 $10{\mu}M$ 첨가한 실험군은 움직임을 보이는 정자의 비율이 $50.4{\pm}2.9%$, 그 중 직진 운동을 보인 정자의 비율이 $31.7{\pm}4%$로 가장 유의적인 차이를 나타냈다 (P<0.05). 이결과는 curcumin을 $10{\mu}M$ 첨가하는 실험군이 동결-보존과정 동안 정자의 세포막에 발생하는 LPO와 산화 스트레스로부터 정자의 운동성을 보존하는 효과가 가장 좋은 농도라는 것을 입증하였다. 또한 Yo-Rro-1/HE double stain 실험기법과 $PI/H_2DCFDA$ double stain 실험기법으로 정자 내 $O_2radical$과 $H_2O_2radical$의 양을 FACS를 이용하여 측정하였다. 그 결과 대조군에 비하면 curcumin을 첨가한 실험군이 세포 내 $O_2radical$과 $H_2O_2radical$을 더 적은 양이 세포 내 분포했으며, 그 중에서도 curcumin을 $10{\mu}M$의 농도로 첨가한 실험군에서 유의적으로 낮은 수치를 보였다. Curcumin은 항산화 물질로서 돼지 정자의 동결보존 시 효용을 보이며, 특히 동결보존액에 curcumin을 $10{\mu}M$의 농도로 첨가했을 때 항산화 효과가 상승한다.
