서 론

우슬은 비름과(Amaranthaceae)에 속하는 다년생 식물로 한국, 중국, 일본 등에 분포하며, 민간에서는 쇠무릎이라 불릴 만큼 관절염에 효과가 있다고 알려져 있다[8, 12, 14, 20]. 한방에서의 우슬은 성미가 평하며, 쓴맛과 신맛을 가지고, 신장과 간장에 작용하여 어혈을 제거하며, 혈액순환을 촉진하고, 혈액을 생성하는 효능과 열을 떨어뜨리는 효능이 알려져 있다[16, 23]. 우슬의 주요 약리성분으로는 oleanolic acid, inocosterone, ecdysterone, beta-sitosterol, stigmasterol, feruloyl tyramine glycoside 등이 알려져 있으며[28], 최근에는 우슬의 지표물질 검정 및 효율적인 분석연구도 진행되고 있으나[29], 아직까지 국내에서는 우슬의 지표성분 함량이 설정되어 있지 않은 상태이다. 우슬에 대한 연구는, 과거 다량 증식을 위한 기내배양 연구[15]에서 우슬의 효율적인 이용을 위한 유용생리활성 탐색으로 전환되고 있으며, 현재 보고된 생리활성으로는 항산화 활성[5, 23], 항균[3, 6] 및 항말라리아 활성[31], 항염증 활성[2, 17], 중금속 제거 및 해독효과[7, 9], 관절염 완화 및 경조직 재생효과[8, 19], 파골세포 분화억제효과[4, 10], 허혈성 뇌손상에 대한 보호효과[22], 혈류개선 [27] 및 간 독성보호[13] 등이 알려져 있으며 최근에는 우슬 분말의 저장안전성 및 독성에 대한 연구[18]가 진행된 바 있다.

우슬은 기원식물이 국가마다 달라, 국내산 우슬의 경우 토우슬(Achyranthes japonica Nakai)을 사용하며, 중국에서는 회우슬(Achyranthes bidentata Blume), 천우슬(Cyathula officinalis Kuan) 및 마우슬(Cyathula capitata Moq)을 사용하고 있다[12, 14]. 그러나 현재 우리나라 대한약전에서는, 국내 자생하는 토우슬과 중국원산의 회우슬의2종을 우슬로 규정하고 있다[12]. 국내에서는 많은 연구가 토우슬에 집중되고 있으나, 중국을 포함한 전세계적으로는 회우슬에 대한 연구가 주로 이루어지고 있는 실정이다. 현재까지 토우슬과 회우슬의 비교연구는 주로 형태분류에 집중되어 있으며, 생리활성 비교연구로는 최근 토우슬과 회우슬의 메탄올 추출물의DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 음이온 소거활성과 간암세포 및 자궁경부암 세포에 대한 항암활성 검정이 보고되어 있을 뿐이다[30]. 따라서 본 연구에서는 우슬을 이용한 고부가가치 식품개발 연구의 일환으로, 우슬의 기원 식물별 성분과 생리활성의 차이를 확인하기 위해 국내산 토우슬과 중국산 회우슬의 ethanol 추출물 및 이의 순차적 유기 용매 분획물을 조제하여 각각의 유용성분을 분석하고, 추출물의 in-vitro 항균활성, 항산화, 및 항당뇨 활성을 비교하여 보고하는 바이다.

재료 및 방법

실험재료

본 실험에 사용된 국내산 토우슬과 중국산 회우슬은 2012년 안동지역 대제한약에서 구입하여 사용하였다(Fig. 1). 국내산 토우슬은 2011년 경북 영천에서 가을에서 수확, 건조한 제품이며, 중국산 회우슬은 2011년 중국 하남성에서 가을에 수확, 건조한 제품이었다. 각각의 우슬은 추출에 적합하도록 세절한 후 95% ethanol (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. Korea)을 우슬 무게의 10배 되도록 가하여 상온에서 3회 추출하였다. 이후 추출액은 filter paper (Whatsman No. 2)로 거른 후 감압 농축(Eyela Rotary evaporator N-1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd. Japan)하여 분말로 조제하였다. 유기용매 분획물 제조의 경우, 각각의 우슬 ethanol 추출물을 물에 현탁한 후 n-hexane, ethylacetate 및 butanol을 이용하여 순차적으로 분획하고 물 잔류물을 회수하였으며[1], 각각의 분획물들은 감압 건조하여 분말화 하였다. 각각의 시료들은 DMSO에 적당한 농도로 녹여, in-vitro 항균활성, 항산화 및 항당뇨 활성 평가에 사용하였다. 기타 사용한 시약은 시약급 이상으로 Sigma Co. (USA)의 제품을 구입하여 사용하였다. 실험에 사용한 우슬은 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다(voucher specimen 2012-WS1, 2012-WS2).

Fig. 1.Photography of the dried roots of Achyranthes japonica Nakai (Korea, left) and A. bidentata Blume (China, right) used in this study.

우슬의 항균 활성

조제된 우슬의 ethanol 추출물 및 이의 분획물의 항균 활성은 기존의 보고된 방법과 동일하게 평가하였다[11]. 항세균 활성평가를 위한 그람 양성세균으로는 Staphylococcus aureus KCTC 1916, Listeria monocytogenes KACC 10550, Bacillus subtilis KCTC 1924를 사용하였으며, 그람 음성세균으로 Escherichia coli KCTC 1682, Proteus vulgaris KCTC 2433, Salmonella typhimurium KCTC 1926, 항진균 활성 평가를 위해서는 Candida albicans KCTC 1940 및 Saccharomyces cerevisiae IF0 0233를 사용하였다. 항세균 활성 평가의 경우, Nutrient broth (Difco Co., USA)에 각각의 세균을 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 각 균주를 O.D.600 0.1로 조정하여 Nutrient agar (Difco Co., USA) 배지를 포함하는 멸균 petri dish (90 × 15 mm, Green Cross Co., Ltd. Korea)에 100 μl 도말하고, 각각의 시료 5 μl를 멸균 disc-paper (지름 6.5 mm, Whatsman No.2)에 가하여, 37℃에서 24시간 동안 배양하였으며, 진균 경우에는 Sabouraud dextrose (Difco Co. USA)를 이용하여 동일한 방법으로 30℃에서 24시간 동안 배양 후, 생육저지환의 크기를 측정하여 항균활성을 평가하였다[11]. 대조구로는 항세균제인 ampicillin과 항진균제인 miconazole (Sigma Co., USA)을 각각 1 μg/disc 농도로 사용하였으며, 생육저지환의 크기는 육안으로 생육이 나타나지 않는 부분의 지름을 mm 단위로 측정하였고, 3회 이상 평가 후 대표 결과로 나타내었다.

우슬의 항산화 활성

우슬 추출물 및 이의 분획물의 항산화 활성은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) anion scavenging activity [DSA], ABTS [2,2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonate)] cation scavenging activity [ASA], nitrite scavenging activity [NSA] 및 환원력 측정으로 평가하였다[26]. 먼저 DSA 측정의 경우, 다양한 농도로 희석한 시료 20 μl에 99.5% ethanol에 용해시킨 2 × 10−4 M DPPH 용액 380 μl를 넣고 혼합하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 516 nm에서 microplate reader (Asys Hitech, Expert96, Asys Co., Austria)를 사용하여 흡광도를 측정하였다. DSA(%)는 시료 첨가구와 비첨 가구의 백분율로 표시하였다[25]. ASA 측정의 경우, 7 mM ABTS (Sigma Co., USA) 5ml와 140mM potassium persulfate 88 ml를 섞은 후 상온에서 16시간 빛을 차단하여 ABTS 양이온을 형성시켰으며, 이후 이 용액을 414 nm에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 ethanol로 희석하였다. 조제된 희석용액 190 μl와 시료 10 μl를 혼합한 후 상온에서 6분간 반응시킨 후 734 nm에서 흡광도를 측정하고 다음의 식에 의해 ASA(%)를 결정하였다[11].

ASA (%) = [(C − S)/C] × 100 C: DMSO 첨가시 흡광도, S: 시료 첨가시 흡광도.

한편 NSA 측정의 경우, 아질산염 용액(1 mM)에 시료용액을 가하고 여기에 0.1 N HCl을 가해 pH 1.2로 조정한 후, 37℃에서 1시간 반응시킨 후 Griess reagent (Sigma Co., USA)를 가하고 혼합하였다. 이후 15분간 실온에서 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 nitrite 양을 측정하였다. NSA(%)는 다음의 식에 의해 계산하였다[11].

NSA (%) = [1 − (A − C)/B] × 100

A: 1 mM nitrite 용액에 시료를 첨가하여 1시간 반응시킨 후의 흡광도, B: 1 mM nitrite 용액의 흡광도, C: 우슬 시료의 흡광도.

환원력 평가의 경우 Oyaizu등의 방법을 변형하여 측정하였다[1]. Ethanol에 용해한 시료 2.5 ml에 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 6.6) 2.5 ml와 10% potassium ferricyanide 2.5 ml를 첨가하고 50℃에서 20분간 반응시킨 후, 10% trichloroacetic acid 2.5 ml를 첨가하여 반응을 종료하고 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 증류수로 2배 희석한 후, 신선하게 조제된 0.1% ferric chloride 용액과 5:1 (v/v) 비율로 혼합하고 700 nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 상기의 항산화 실험에서 대조구로는 vitamin C (Sigma Co., USA)를 사용하였으며, 용매 대조구로는 DMSO를 사용하였다. 각각의 활성 평가는 각각 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 표시하였다.

우슬의 항당뇨 활성

항당뇨 활성은 in-vitro α-amylase 저해 활성과 α-glucosidase 저해 활성을 평가하여 나타내었다. 먼저 α-amylase 저해활성은 Lim 등[21]의 방법을 수정하여 사용하였으며, 우슬 시료 2.5 μl와 50 mM phosphate buffer (pH 6.8)로 희석한 α-amylase (0.25 U/ml) 25 μl를 혼합하여 37℃에서 10분간 preincubation 한 후, 0.5% soluble starch (Samchun Chemicals Co., Korea) 25 μl를 가하여 37℃에서 10분간 반응하였다. 이후 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시켰으며, 반응액에 150 μl의 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid, Sigma Co., USA) 용액을 가하여 100℃에서 5분간 가열하여 발색한 후 상온에서 방냉하였다. 발색액은 96 well microplate reader(Tecan Co., USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 각각의 실험은 3회 반복한 후 평균값을 구하여 다음의 식으로 저해율을 계산하였다.

저해율(%) = [1 − (시료 첨가구 효소활성/대조구 첨가구 효소활성)] × 100

α-glucosidase 저해활성은 pNPG (p-nitrophenol glucoside; Sigma Co., USA)를 이용하여 평가하였으며[21], 우슬 시료 2.5 μl와 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.6)로 희석한 α-glucosidase (0.25 U/ml) 25 μl를 혼합하여 37℃에서 10분간 preincubation 하고 1 mM pNPG 용액 25 μl를 가하여 60℃에서 10분간 반응하였다. 이후 1M NaOH 25 μl를 가하여 반응을 정지시키고, 405 nm에서 흡광도를 측정하여 저해율을 계산하였다.

기타 분석

우슬의 수분함량은 적외선 수분측정기(HG53 Halogen Moisture Analyzer, Mettler-Toledo International Inc., Zurich, Switzerland)로 측정하였으며, 추출물의 pH 측정은 320 pH meter (Mettler Toledo InLabR 413, UK)로 측정하였다. 색차측정은 색차계(Chromatometer CR-300, Minota, Japan)를 이용하여 백색도(L value, lightness), 적색도(a value, redness) 및 황색도(b value, yellowness) 값을 3회 반복 측정하여 색차(E)를 계산하였다. 표준 백색판은 L 값이 92.39, a 값이 −0.08, b 값이 1.39이었으며, 색차(E)는 다음의 식을 이용하여 계산하였다.

한편 추출물의 총 flavonoid의 함량 측정은 기존의 보고한 방법[25]에 따라 측정하였으며, 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고 여과한 추출검액 400 μl에 90% diethylene glycol 4 ml를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 μl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다. 총 polyphenol 함량은 추출검액 400 μl에 50 μl의 folin-ciocalteau, 100 μl의 Na2CO3 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다[24]. 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid 법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[26]. 각각의 분석결과는 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다.

통계분석

실험 결과는 SPSS 20.0 버전을 사용하여 mean ± SD로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, Duncan 다중비교 검증법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준은 p < 0.05로 하였다.

결과 및 고찰

토우슬과 회우슬의 관능적 특성 및 성분 비교

국내산 토우슬은 가늘고 긴 원주형의 뿌리를 가지며, 황갈색을 띄며, 상대적으로 전분립이 적어 단단하고 부서지기 쉬운 형태로, 냄새는 거의 없으며, 씹을 때 단맛이 느껴졌다. 반면 중국산 회우슬은 굵고 곧게 뻗은 긴 원주형의 뿌리를 가지며, 담갈색을 띄며, 푸석푸석하여 쉽게 부서지며, 냄새가 있으며, 씹을 때 단맛, 쓴맛, 떫은 맛이 함께 느껴졌다(Fig. 1). 한편 토우슬 및 회우슬의 수분함량은 각각 9.13% 및 10.89%로 차이가 나타났으나, 에탄올 추출 효율은 5.0-5.1%로 차이가 나타나지 않았다. 추출물의 pH와 색차 분석결과 역시 유의성이 인정되지 않았다(Table 1). 토우슬과 회우슬의 에탄올 추출물의 분획효율 및 성분 분석 결과는 Table 2에 나타내었다. 토우슬의 경우 n-hexane과 ethylacetate 분획의 총량이 8.5%에 달하며, 분획물 중 butanol 분획물과 물잔류물이 각각 42.4% 및 47.3%로 나타났다. 회우슬의 경우에는 n-hexane과 ethylacetate 분획의 총량이 3.6%이며, 분획물 중 butanol 분획물과 물 잔류물이 각각 32.0% 및 64.2%로 나타났다. 또한 에탄올 추출물의 총당 및 환원당 함량은 회우슬 추출물이 토우슬보다 1.26-1.44배 높은 함량을 나타내었다. 이러한 결과는 비록 토우슬과 회우슬의 에탄올 추출물 효율은 유사하나, 토우슬 추출물이 회우슬 추출물보다 지용성 물질을 많이 포함하며, 회우슬의 경우 상대적으로 수용성 당류를 많이 포함하고 있음을 의미한다. 한편 총플라 보노이드 함량 분석결과, 토우슬에서는 n-hexane 분획에서 가장 높은 함량(2.61 mg/g)을 나타내었으나, 회우슬에서는 ethylacetate 분획에서 가장 높은 함량(19.05 mg/g)을 나타내어 성분상의 차이가 나타났다. 특히 회우슬이 ethylacetate 분획은 토우슬의 ethylacetate 분획에 비해 당 함량이 25% 정도로 매우 낮은 특징을 나타내었다. 총 폴리페놀 함량 분석 결과, 토우슬에서는 모든 분획물에서 2.38-4.66 mg/g의 분포를, 회우슬의 분획물에서는 4.91-8.32 mg/g의 분포를 나타내어, 토우슬 및 회우슬 모두 다양한 종류의 폴리페놀류들을 함유하고 있으며, 회우슬이 토우슬보다 상대적으로 많은 총 플라보노이드 및 총폴리페놀 함량을 나타냄을 확인하였다.

Table 1.aAJN: Achyranthes japonica Nakai. bABB: Achyranthes bidentata Blume. Data are presented as the mean ± SD of three determinations. *p < 0.05 compared with AJN.

Table 2.aAJN: Achyranthes japonica Nakai. bABB: Achyranthes bidentata Blume. cex: extract. dfr: fraction. Data are presented as the mean ± SD of three determinations. *p > 0.05 compared with counterpart of AJN or ABB.

토우슬과 회우슬의 항균활성 비교

토우슬 및 회우슬의 에탄올 추출물 및 이의 순차적 유기 용매 분획물의 항균활성 평가 결과는 Table 3에 나타내었다. 먼저 대조구로 사용된 ampicillin과 miconazole은 다양한 병원성 세균, 식중독 세균 및 진균에 우수한 항균활성을 나타내었다. 각각의 우슬 에탄올 추출물은 사용된 세균 및 진균에 대해 항균 활성이 거의 인정되지 않았으며, 분획물에서 가장 많은 양을 차지하는 물 잔류물의 경우 항균활성이 나타나지 않았다. 반면 분획물 중 각각의 n-hexane 및 ethylacetate 분획에서는 대장균을 제외한 세균에서 양호한 항세균 활성이 나타났다. 따라서 토우슬 및 회우슬은 지용성 항세균 활성물질을 포함하고 있음을 알 수 있으며, 토우슬 추출물이 회우슬 추출물보다 n-hexane 및 ethylacetate 분획의 지용성 분획 함량이 2.4배 많음을 고려할 때, 토우슬이 회우슬보다 항균 활성이 우수하리라 판단된다. 한편 토우슬의 경우 butanol 분획에서 회우슬과는 달리, Bacillus subtilis와 Salmonella typhimurium에 대해 약한 항균활성이 나타났다.

Table 3.The concentration of ampicillin or miconazole used was 1.0 μg/disc, respectively.aAJN: Achyranthes japonica Nakai. bABB: Achyranthes bidentata Blume. cex: extract. dfr: fraction. eLM: Listeria monocytogenes. fSA: Staphylococcus aureus. gBS: Bacillus subtilis. hEC: Escherichia coli. iST: Salmonella typhimurium. jPV: Proteus vulgaris. kCA: Candida albicans. lSC: Saccharomyces cerevisiae. mNA: No activity.

토우슬과 회우슬의 항산화능 비교

먼저 토우슬 및 회우슬의 에탄올 추출물 및 분획물들의 항산화 활성을 DSA 및 ASA로 평가한 결과(Table 4), 회우슬 추출물 및 분획물이 토우슬 추출물 및 분획물보다 우수함을 알 수 있었으며, 토우슬 및 회우슬의 에탄올 추출물 및 n-hexane 분획물의 DSA 활성의 경우에는 유의적이지 않았다(p > 0.05). 최근 토우슬과 회우슬의 메탄올 추출물의 DSA 평가결과, 회우슬의 IC50가 0.75 mg/ml, 토우슬의 IC50가 1.19 mg/ml로 보고되어 회우슬이 토우슬보다 우수한 DSA를 나타낸다고 보고[30]되었으나, 두 추출물들의 DSA 활성이 전체적으로 미약하므로 큰 차이는 나타나지 않는 것으로 이해된다. 한편 각각의 우슬 분획물 중 ethylacetate 분획에서 가장 강력한 항산화 활성이 보였고, DSA의 경우 0.5 mg/ml 농도에서 vitamin C (0.01 mg/ml)만큼 강력한 활성을 나타내었으며, 특히 회우슬이 우수한 활성을 나타내었다. 반면, ASA의 경우 각각의 ethylacetate 분획은 1.0 mg/ml 농도에서 vitamin C (0.01 mg/ml)에 필적하는 활성을 나타내어 우슬의 ethylacetate 분획물은 상대적으로 양이온보다는 음이온에 대한 소거능이 우수함을 알 수 있었다. 한편 환원력의 경우, 회우슬이 토우슬보다 전체적으로 강력한 활성을 나타내었으며, 특히 n-hexane 분획물을 제외한 다른 분획물에서는 1.7-2.3배 우수한 활성을 나타내었다. 따라서 항산화능의 경우, 토우슬보다 회우슬이 ASA 및 환원력이 더욱 우수함을 확인하였다.

Table 4.aAJN: Achyranthes japonica Nakai.bABB: Achyranthes bidentata Blume. cex: extract. dfr: fraction. Data are presented as the mean ± SD of three determinations. *p > 0.05 compared with counterpart of AJN or ABB.

우슬 추출물 및 이의 분획물의 NSA 평가는 Table 5에 나타내었다. 토우슬과 회우슬의 에탄올 추출물에서는 NSA의 유의적인 차이가 나타나지 않았으나, 분획물에서는 전체적으로 회우슬이 토우슬보다 NSA 활성 증가가 나타났다(p < 0.05). 2종 우슬의 분획물 중 강력한 NSA 활성은 n-hexane 및 ethylacetate 분획에서 나타났으며, 이들의 경우 0.1 mg/ml 농도에서 vitamin C (0.01 mg/ml) 보다 우수한 활성을 나타내었다.

Table 5.aAJN: Achyranthes japonica Nakai.bABB: Achyranthes bidentata Blume. cex: extract. dfr: fraction. Data are presented as the mean ± SD of three determinations. *p > 0.05 compared with counterpart of AJN or ABB.

토우슬과 회우슬의 항당뇨 활성 비교

토우슬 및 회우슬의 에탄올 추출물 및 분획물들의 항당뇨 활성을 측정한 결과는 Table 6에 나타내었다. 먼저 임상에서 사용되고 있는 acarbose는 0.1 mg/ml의 저농도에서도 α-amylase 및 α-glucosidase 활성을 49.4% 및 5.2% 저해하여 우수한 항당뇨 활성을 확인하였다. 토우슬 및 회우슬의 에탄올 추출물에서 α-amylase 및 α-glucosidase 저해활성은 거의 유사하였으나, 분획물에서는 차이를 나타내었다. 각각의 분획물들은 모두 양호한 α-amylase 저해를 나타내었으며, 특히 토우슬에서는 n-hexane 분획에서, 회우슬에서는 n-hexane 분획 및 ethylacetate 분획에서 우수한 활성을 나타내었다. 반면 α-glucosidase 저해활성의 경우, 토우슬과 회우슬의 에탄올 추출물 및 n-hexane 분획물은 차이가 없었으며, 1.0 mg/ml 농도에서 토우슬의 경우 모든 분획물에서 9-12.8%의 저해가 나타난 반면, 회우슬은 2.7-7.5%의 낮은 저해활성을 나타내었다. 따라서 in-vitro 항당뇨 활성의 α-glucosidase 저해활성의 경우 회우슬의 분획물보다 토우슬의 분획물이 다소 우수한 것으로 확인되었다. 상기의 결과를 종합할 때, 국내에서 동일 약재로 사용되고 있는 토우슬과 회우슬은 추출물의 경우 성분 및 효능에서 매우 유사하나, 분획물의 경우 성분 및 활성의 차이가 나타남을 확인하였으며, 특히 우슬 추출물의 분획물을 이용한 기능성식품 및 천연물 신약 개발시에는 국내산 토우슬과 중국산 회우슬을 구분하여 사용하여야 할 것으로 판단된다. 본 연구결과는 우슬을 이용한 고부가가치 식품 개발 기본자료로 활용될 것이다.

Table 6.aAJN: Achyranthes japonica Nakai.bABB: Achyranthes bidentata Blume. cex: extract. dfr: fraction. Data are presented as the mean ± SD of three determinations. *p > 0.05 compared with counterpart of AJN or ABB.