재료 및 방법

실험재료 −본 실험에 사용된 오리방풀(Isodon excisus (Max.) Kudo)은 2012년 8월경 지리산 일원에서 채집한 후 건조하여 사용하였으며, 한국인삼연구소 이상명 박사가 동정하였고, 표본은 대구한의대학교 표본실에 보관하였다.

시약 및 기기 −세포배양에 사용된 DMEM 배지, fetal bovine serum(FBS)는 Gibco Laboratorie사에서 구입하였다. Tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 추출 및 분획용 용매는 모두 특급 시약을 사용하였고, 성분 분리를 위한 순상 column chromatography용 silica gel은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, ASTM, Merck)을 사용하였고, 물질분리 및 확인에 사용한 TLC plate는 Merck TLC plate silica 60F254를 사용하였고, HPLC는 Hitachi사(Japan)의 기기를 통하여 측정하였고, column은 Shisheido사의 CAPCELL PAK C18(250×10 mm, Japan)를 이용하였다. Mass 스펙트럼은 ESI-MS(electrospray ionization mass spectrometry, Fisons VG Quattro 400 mass spectrometer, USA)를 사용하여 측정하였고, 1H-NMR은 Varian UNITY 300(USA)기기로 CD3OD용매를 이용하여 측정하였다.

ORI2 화합물의 추출 및 분리 −오리방풀(Isodon excisus) 2.5 kg을 2주 동안 메탄올에 추출, 여과 후 농축하여, 얻어진 MeOH extract(39 g)를 증류수(1 L)에 현탁시켜, n-hexane, EtOAc, n-BuOH 및 H2O 순으로 분획 후, 그 중 가장 우수한 효과를 나타낸 EtOAc 분획물(5 g)을 CHCl3: MeOH=20:1부터 단계적으로 극성을 높인 전개용매를 이용하여 silica gel column chromatography를 실시하였고, 이를 통해 얻은 활성분획(42 mg)을 HPLC(Shisheido-CapCell Pak C18 UG120, 250×10 mm, UV 220 nm, CH3CN gradient 20-100%, flow 1.5 ml/min)을 통해 정제한 후, 분자량과 1H-NMR data로부터 본 연구팀이 보고한바 있는 선행 문헌8)과 비교를 통해 (3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylic acid 1-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-methoxycarbonylethyl ester (5.8 mg) (C19H18O8; MW 374)로 동정되었다(Fig. 1).

Fig. 1.Chemical structure of ORI2 (3-[3,4-dihydroxyphenyl] acrylic acid 1-[3,4-dihydroxyphenyl]-2-methoxycarbonylethyl ester).

ORI2 (3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylic acid 1-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-methoxycarbonylethyl ester): 1H-NMR data (300 MHz, CD3OD) 6.40 (1H, d, J=15.8 Hz, H-2), 7.64 (1H, d, J=15.8 Hz, H-3), 5.20 (1H, dd J=7.2, 5.7 Hz, H-1'), 3.01 (2H, d, J=7.2 Hz, H-2'), 6.71 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2''), 6.69 (1H, d, J=8.0 Hz, H-5''), 6.57 (1H, dd, J=8.0, 2.0 Hz, H-6''), 6.69 (1H, d, J=2.1 Hz, H-2'''), 6.78 (1H, d, J=7.8 Hz, H-5'''), 6.96 (1H, dd, J=7.8, 2.1 Hz, H-6'''), 3.67 (3H, s, OCH3); ESI-MS: m/z 375 [M+H]+

Virus and Cell lines − Coxsakievirus B4는 America Tissue Culture Collection (ATCC)의 기준 바이러스의 혈청형을 구입하여 사용하였다. 바이러스 역가는 이전의 논문에서 기술한 바와 같이 HeLa cell에서 plague forming unit (PFU) assay를 통해 결정하여 실험에 사용하였다.10) 요약하면, 바이러스 감염 세포 상등액을 준비하고 6-well plate에 배양된 HeLa 세포에 30분간 감염시킨 후 3% Difco agar/DMEM을 3 mm로 덮고 37℃ CO2 배양기에서 이틀간 배양하여 plaque forming unit(PFU) assay로 바이러스 역가를 측정하였다. HeLa cell은 10% fetal bovine serum이 포함된 Dulbecco's Modified Eagle medium(DMEM)에서 배양하였다. HeLa-UVM cell은 삼성서울병원(전은석교수)에서 분양 받았다.11)

세포생존 실험 − Cell survival assay를 통해 화합물의 항바이러스 활성을 실험하여 CVB4 증식 억제 물질을 선별하였다.7) 간단히 요약하여, HeLa cell을 104 PFU/ml로 CVB4를 30분간 감염시키고 5% FBS DMEM에 순차적으로 희석한 화합물을 처리하였다. 18시간 감염 후, 세포 증식 검출시약인 Cell Counting Kit 8(CCK-8) 7 μl를 넣고 2시간동안 더 배양하였다. Microplate reader(Molecular device, USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존을 확인하여 항바이러스 효능을 확인하였다

Western Blot Analysis −세포의 단백질은 RIPA buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1% SDS, 1% NP40, 150 mM NaCl, 0.5% sodium deoxycholate)로 분리하였다. 전체 세포 추출물의 aliquot을 12% SDS-PAGE gel에 loading하였다. 전기영동을 한 후, 단백질을 Hybond-ECL nitrocellulose membrane으로 transfer하였다. Membrane은 5% non-fat dry milk solution으로 block하고 anti-enterovirus VP1 (1:1000, mouse monoclonal antibody)과 GAPDH antibodies(1:1000, raddit polyclonal antibodies; Cell signaling, USA)로 probe 하였다.

바이러스 유전자 검출 − RNA 바이러스인 CVB4의 유전자 증폭을 검증하기 위해 TRIzol reagent(Invitrogen, USA)로 세포를 분리하여 RNA를 추출하고 전체 추출물의 aliquot 중 2μl를 주형으로 Maxime Reverse-transcription(RT) kit(IntronbBiotech, Inc., KOR)을 사용하여 RT를 수행하였다. 이때 바이러스의 positive 가닥 증폭을 위해 VP1-antisense primer(5'-CACCGGATGGCCAATCCA-3')로 먼저 RT 반응을 수행하여 cDNA를 생산하고 생산된 cDNA를 주형으로 VP1-AS와 VP1-sense primer(5'-GCGAAGAGTCT ATTGAGCTA-3')를 사용하여 Polymerase Chain Reaction(PCR)을 수행하고 1.5% agarose gel에 전기영동 하여 확인하였다.

통계처리 −모든 결과는 mean±SEM으로 나타냈다. Control과 바이러스 감염 그룹 간의 결과는 Mann-Whitney nonparametric t-test(GraphPad Prism 3.0 for Windows; GraphPad Software, La Jolla, USA)를 이용하였다. 통계적 유의성은 P<0.05로 정하였다.

결과 및 고찰

In vitro Antiviral Effect of ORI2 − 항바이러스 화합물을 찾기 위해서 CVB4에 대한 항바이러스 효과를 HeLa cell의 생존율 분석을 통해 검증하였다. 이중 CVB4에 감염된 HeLa cell의 생존율은 ORI2의 처리에 의해 유의하게 증가하였으며, 특히 농도에 의존적으로 항바이러스 효과를 나타냈다(Fig. 2). 특히 비교적 낮은 농도인 0.001 μM에서 50%의 세포 생존을 나타내 ORI2가 장내바이러스인 CVB4에 대한 강력한 항바이러스 효과를 확인하였다.

Fig. 2.Test of anti-enterovirus compounds. The antiviral activity of ORI2 was tested by using a HeLa cell survival assay following coxsackievirus B4 infection. Treatment with 1 mM ORI2 significantly increased cell survival compared to untreated cells. Data are presented as the mean plus or minus the standard error of the mean from 3 independent experiments (**P<0.01).

CVB4 바이러스 단백질 생산 억제 − 104 PFU/ml CVB4를 단층 HeLa cell이 배양된 12 well-plate에 첨가하고 30분간 감염 시킨 후, 1 mM에서 0.1 mM 농도로 ORI2를 처리하였다. 18시간이 지난 후, 전체 단백질을 추출하여 western blot을 수행하였다. 그 결과, CVB4의 막단백질 VP1은 ORI2의 투여농도에 따라 유의한 감소를 나타내었다(Fig. 3A). 특히 바이러스가 증식할 때 생산하는 바이러스의 protease 2A 효소에 의해 절단되는 전사요소 단백질 eIF4GI는 세포의 단백질 생산과 생존에 매우 중요한 단백질로 바이러스 증식시 세포의 단백질 생산 억제를 위해 CVB3 바이러스 protease 2A에 파괴 되게 된다. ORI2의 처리농도에 따라 eIF4GI의 파괴가 급격히 감소하여 윗부분의 정상 단백질이 많이 남았으며 ORI2를 처리하지 않았을 때는 바이러스 증식에 의한 portease 2A의 생산에 의해 정상 단백질은 모두 파괴되고 밑부분의 잘려진 단백질만 일부 확인되었다. 이러한 결과는 오리방풀(I. excisus)에 함유된 페닐프로파노이드 성분인 ORI2가 CVB4 감염된 HeLa cell에서 CVB4 복제 억제에 효과적인 것을 보여주고 있다(Fig. 3B).

Fig. 3.ORI2 inhibits CVB4 replication. (A) ORI2 was added to HeLa cells following CVB4 infection. Virus replication was dramatically reduced by ORI2 in a dose-dependent manner. Virus capsid protein VP1 was dramatically decreased by ORI2 treatment. In addition, transcription factor eIF4GI cleavage was protected, respectively (Upper arrow: full size, lower arrow: cleaved size). Data are presented as the mean plus or minus the standard error of the mean from 3 independent experiments (***P<0.001).

ORI2 Inhibit CVB4 Replication in HeLa Cells − ORI2의 CVB4 증식을 배양세포 상등액의 생바이러스 농도를 PFU assay를 통해 확인하였다. CVB4 감염 후 OIR2를 처리하여 배양한 세포의 배양액을 얻어 HeLa cell에 처리하고 PFU assay를 수행하여 생바이러스의 농도를 측정하였다. 결과에서 보여주는 것과 같이 ORI2의 처리는 농도에 따라 강력하게 CVB4의 복제와 증식을 억제하였다(Fig. 4). 이 결과를 통해 감염세포에서 바이러스의 단백질 생산 저해와 새로운 바이러스의 생성 억제에 ORI2가 매우 효과적으로 작용하고 있음을 알 수 있었다.

Fig. 4.Live virus propagation. ORI2 was added to HeLa cells following CVB4 infection. (A) Cell supernatant virus titer was confirmed by PFU assay in HeLa cells. Virus titer in the supernatant was significantly decreased in a dose dependent manner of ORI2. Data are presented as the mean plus or minus the standard error of the mean from 3 independent experiments (***P<0.01, **P<0.01).

CVB4 유전자 증폭 억제 − CVB4 감염 HeLa cell에서 ORI2의 바이러스 유전자 증폭 억제 효과를 rt-PCR을 수행하여 막 단백질 VP1의 positive strain 농도를 측정하였다. 바이러스의 positive strain은 직접적인 바이러스의 증식보다는 바이러스 유전자 증폭과 유전자 존재의 유무를 확인할 수 있는 매우 강력한 확인 방법으로 작은 양의 바이러스 유전자도 증폭하여 검출 할 수 있다. ORI2의 처리는 CVB4 바이러스의 유전자 증폭을 강력하게 저해 하였다(Fig. 5). 직접적인 바이러스의 증식이 저해 되어 바이러스의 유전자가 감소된 것과 동일한 결과이며 ORI2가 감염세포에서 전반적인 바이러스의 증식을 억제 할 수 있음을 확인하였다.

Fig. 5.ORI2 inhibit CVB4 gene amplification. CVB4 gene amplification was confirmed by rt-PCR. CVB4 capsid protein VP1 gene amplification was significantly decreased by ORI2 treatment. Virus VP1 gene detection level showed a strong correlation with viral protein and new virus production in vitro. Data are presented as the mean plus or minus the standard error of the mean from 3 independent experiments (***P<0.01, **P<0.01).

이상의 결과는 국내자생식물에 함유된 천연성분으로서 항바이러스 활성성분을 개발할 수 있다는 가능성을 제시하였다. 최근 장내바이러스 속 바이러스들은 많은 일반 질병들의 발생 원인이 되고 있으며 특히 아이들에게 다양한 전염병을 유발하는 원인이다.12,13) Enterovirus71은 수족구병의 주요 원인으로 잘 알려져 있다.14,15) 본 실험에서 국내 자생식물인 오리방풀(I. excisus)의 페닐프로파노이드계 화합물 ORI2는 CVB4 감염 HeLa cell의 생존율 유지를 실험하기 위해 사용되었으며 ORI2 처리에 의해 CVB4의 복제가 강하게 억제되었다. 특히 HeLa cell에서 바이러스 막 단백질의 생산이 유의하게 감소되었고, 새로운 생바이러스의 증식이 현저히 억제 되었다. 또한 바이러스 증식에 의해 증가되는 CVB4 유전자의 복제와 증폭도 ORI2 화합물 처리에 의해 상당히 감소시키는 것을 발견하였다.

많은 항바이러스 약물들이 Balb/C 생쥐에서 CVB4에 의해 유발된 췌장염에 대항하여 실험되었고,2) 그 결과는 급성바이러스 복제가 직접적인 췌장 손상을 유도하는 세포면역반응을 유발하는 것을 보여주었다.3,6,16) 이러한 이전의 연구결과들은 급성 바이러스 복제와 세포면역반응 두 가지를 다 막는 것이 장내바이러스 감염을 치료하는 것에 매우 효과적인 치료방법이 될 수 있다고 주장한다.17,18) 그러한 이유로, 항염증 기능은 이미 밝혀진 많은 천연화합물의 항바이러스 효과가 실험 되었다. 특히 만성질환을 유발할 수 있는 것으로 밝혀진 몇몇 바이러스에 대한 증식억제 물질 개발은 많은 관심과 연구가 수행되고 있다. 만성 췌장염은 고통스러운 질병중의 하나로 알려져 있으며 exocrine pancreas 의 염증에 의한 파괴로 발생하게 되며 소화기능의 장애를 일으키며 장기적으로 베타세포의 호르몬 이상분비를 야기하여 만성질환을 일으키게 된다. 이러한 초기염증의 유도가 바로 CVB4의 감염에 의해 유도될 것으로 생각 되고 있으며 다양한 연구를 통해 증명이 되고 있다.

본 연구팀은 몇몇 후보 화합물을 확보하였고, 그들의 항바이러스 활성을 평가하였다. 오리방풀 추출물로부터 분리 된 ORI2는 이전 연구에서 항 세포 사멸 효과를 보여주었다.8) 또한, 본 연구에서 enterovirus와 같은 장내바이러스인 CVB4에 대한 강력한 바이러스 증식 억제 효과를 보여주었다.

결 론

본 연구에서는 오리방풀(Isodon excisus)로부터 분리한 페닐프로파노이드계ORI2 화합물의 CVB4에 대한 항바이러스 효과를 측정하였으며, ORI2의 CVB4에 대한 유전자 복제와 바이러스 증식억제 효과를 세포 실험을 통해 확인하였다. 향후 CVB4에 의해 유도된 췌장염 동물 모델에서 그 실제 효능을 연구해야 할 것으로 사료되며, 이번 항바이러스 결과를 통해 볼 때 ORI2가 장내바이러스 췌장염의 치료약물로서 개발 될 수 있을 것으로 기대된다.