서 론

식이요법 및 건강에 대한 소비자의 지식수준과 욕구가 높아지면서 프로바이오틱스와 같은 건강지향성 기능성제품의 수요가 증가하고 있다. 프로바이오틱스 균주로는 Lactobacillus sp., Bacillus sp., Enterococcus sp. 및 Pediococcus sp. 등이 이용되고 있으며, 최근 B. licheniformis, B. pumilis, B. polyfermenticus 및 B. amylopiquefaciens 등 다양한 Bacillus sp. 균주가 프로바이오틱스로서 이용되거나 연구되고 있다[8, 13]. 특히, 이 속의 균주는 다양한 효소와 박테리오신 생산, siderophore 형성과 같은 유산균과는 다른 기능성으로 주목받고 있다. 현재 B. polyfermenticus를 이용한 ‘Bispan’이란 제품이 프로바이오틱스로서 이용되고 있으며[9], 그 외에도 Paenibacillus sp.를 포함한 다수의 Bacillus 균주가 생균제로서 연구 개발이 진행 중이다.

한편, 프로바이오틱스 균주들은 직접적으로 장 상피세포와 peyer’s patches, 수지상 세포 등과 반응하며 면역계를 자극해 장 질환을 예방하거나, 간접적으로는 병원성 장내세균과 영양소를 경쟁적으로 이용함으로써 병원균의 생장을 억제하며, 병원성 미생물과 경쟁적으로 장 점막 부착부위를 선점하여 병원균의 부착을 억제함으로써 장 건강 유지에 기여하는 정장작용을 대표적인 기능으로 가지고 있다. 또한 혈중 콜레스테롤 수치 감소, 면역 증진, 유해효소의 합성억제, 유당 불내증의 개선과 박테리오신, 유기산 등의 생성에 의한 장내 유해균의 증식 억제, 설사치유 및 항산화 효과와 관련되어 그 기능성이 보고 되고 있다[5].

따라서 본 연구에서는 젖갈로부터 Paenibacillus sp. BCNU 5016을 분리하여 안전성, 안정성 및 병원성 균주에 대한 길항 능력 등을 평가함으로써 새로운 프로바이오틱스 균주로서 개발하기 위한 기초자료를 획득할 목적으로 본 연구를 수행하였다.

재료 및 방법

균주 선별 및 동정

다양한 종류의 젖갈 1 g을 PBS (phosphate buffered saline, pH 2.0) 용액에 첨가해 2시간 정치 후, nutrient agar (NA)에 도말하여 낮은 pH에 내성이 있는 집락을 1차 선별하였으며, 식중독 원인균에 대한 항균활성 검증을 통해 항균스펙트럼이 넓은 균주를 최종 선발하였다. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology [14]를 참고하여 생리·생화학적 특성을 조사하였으며, 16S 리보좀 DNA 염기서열 분석을 통해 계통수를 작성하였다[11].

균주의 안전성 조사

In vitro 조건에서 면양혈액한천배지를 이용하여 용혈성 여부를 조사하였고, 암모니아, 인돌, 및 phenylpyruvic acid 등의 유해대사산물 생성여부 그리고 ß-glucosidase, ß-glucuronidase 및 urease 등 유해효소 생성여부 조사하였다[2, 6]. Escherichia coli (ATCC 10798)와 Lactobacillus acidophilus (ATCC 4356)를 음성과 양성 대조군으로 사용하였다.

산성 및 담즙산에 대한 안정성 조사

pH를 2.5-4.0으로 조절한 PBS 용액에 균 배양액을 접종하여 37℃에서 4시간 동안 배양하면서 시간별로 채취하여 생존률을 조사하였다. 담즙에 대한 저항성은 0.3%와 0.6% oxgall (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)이 함유된 nutrient broth (NB) 배지에 배양액을 접종하여 일정시간 동안 배양하였으며, 균의 증식 정도는 흡광도(600 nm)로 측정하였다[6].

항생제 감수성 조사

NB 배지에 0.1%의 균배양액을 접종하고 8종의 항생제를 농도를 달리하여 첨가한 후, 30℃에서 24시간 배양 후 항생제의 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 조사하였다. 항생제의 최소억제범위는 European Food Safety Authority (EFSA), Scientific Committee on Animal Nutrition (SCAN)의 판정기준과 비교하였다.

항균활성 측정

분리균주에 대한 항균활성은 식중독 원인균인 그람양성균 2종[Bacillus cereus KCTC 3624 (ATCC 14579), Staphylococcus aureus IMSNU 11088 (ATCC 6538)]과, 그람음성균 7종[Escherichia coli IMSNU 10080 (ATCC 10798), Klebsiella pneumonia KACC 15313 (ATCC 13883), Pseudomonas aeruginosa KCTC 1926 (ATCC 10145), Shigella sonnei KCTC 2518 (ATCC 25931), Salmonella typhimurium KCTC 1926 (ATCC 14028), Vibrio alginolyticus KCTC 2472 (ATCC 17749), V. parahaemolyticus KCTC 2471 (ATCC 17802)]에 대해 평판배지확산법(8 mm paper disc)으로 측정하였으며 각 균주의 최적온도에서 배양 후 생육억제환의 크기(직경 mm)로 항균활성을 측정하였다.

장내 유해균에 대한 성장억제 활성 측정

설사유발 원인균인 E. coli와 S. sonnei에 대한 성장억제 활성도는 각 실험균주와 분리균주를 일정비율(10:10, 10:1, 10:0)로 혼합하여 동시 배양하였고, NB agar 배지와 eosin-methylene blue (EMB) agar 배지를 이용하여 총 균수와 E. coli 및 S. sonnei 집락수를 계수하였다[7].

세포표면 소수성 및 응집능력

분리균주의 장내 부착성은 xylene과 hexadecane 등 4종의 유기용매에 부착하는 정도를 흡광도로 측정함으로써 확인하였으며, 자가응집 및 병원성 세균과의 공동응집능은 Dolye과 Rosenberg의 방법을 응용하여 측정하였다[3].

결 과

균주의 선별 및 동정

내산성과 식중독 원인균에 대해 항균스펙트럼이 넓은 균주를 25여 종 분리하였으며, 가장 활성이 뛰어난 균주를 최종 선별하여 BCNU 5016으로 명명하였다. BCNU 5016은 그람양성균으로 최적생육온도는 30℃, pH 4.0-7.5 그리고 2-9%의 염 농도에서 활발히 증식했으며, lecitinase와 gelatinase는 생산하지 않는 것으로 조사되었다(Table 1). 16S 리보좀 DNA 염기 서열 분석결과, Paenibacillus polymyxa 표준균주와 99%의 상동성을 보였으며 계통적으로 P. polymyxa의 subcluster에 속하는 것으로 확인되어 최종적으로 Paenibacillus sp. BCNU 5016으로 명명하였다(Fig. 1).

Table 1.1) +: Positive, −: negative

Fig. 1.A phylogenetic tree, showing the position of Paenibacillus sp. BCNU 5016 among the Paenibacillus species. Bootstrap values expressed as a percentage of 1,000 replications were given at the branching points. The scale bar represents 1% sequence dissimilarity.

Paenibacillus sp. BCNU 5016의 안전성

In vitro 조건에서 인체에 유해성을 나타낼 수 있는 여러 인자를 조사한 결과, BCNU 5016은 GRAS 균주인 유산균과 같이 비병원성인 γ-용혈을 나타내는 것으로 확인되었으며, 유해 대사산물인 암모니아, 인돌 및 phenylpyruvic acid를 생성 하지 않았다. 또한 유해효소인 β-glucuronidase, β-glucosidase 및 urease를 생성하지 않는 것으로 나타나 Paenibacillus sp. BCNU 5016은 안전성이 있는 것으로 판단된다(Table 2).

Table 2.1) Positive control: E. coli ATCC 10798 2) Negative control: L. acidophilus ATCC 4356

항생제 감수성

BCNU 5016은 7종의(ampicillin, cephradine, gentamicin, lincomycin, kanamycin, oxymycin, streptomycin 및 tetracycline) 항생제에 대하여 감수성을 가지고 있었으며, 특히 tetracycline에서는 0.006 μg/disc 정도의 농도에서도 매우 민감한 감수성을 나타내었다. 따라서 EFSA와 SCAN의 판정기준과 비교할 때 모두 감수성을 가지며 항생제 내성 유전자를 전달하지 않을 것으로 판단된다(Table 3).

Table 3.1) Diameter of inhibition from three individual experiments was measured at the minimal inhibitory concentration (MIC); (S): sensitive; (R): resistant

Paenibacillus sp. BCNU 5016의 안정성

Paenibacillus sp. BCNU 5016은 다양한 범위의 산성 환경에서의 생존 능력을 조사한 결과, pH 2.5에서 4시간 배양 후에도 90% 이상의 생존률을 보여 산성조건에 대한 내성이 큰 것으로 나타났으며(Fig. 2), 0.3% oxgall이 함유된 배지에서 높은 생장률을 보여 oxgall에도 내성을 가지고 있는 것으로 조사되었다(Fig. 3). 현재 정장제로 사용되는 B. polyfermenticus를 같은 조건에서 실험했을 때 pH 2.5와 0.3% oxgall에서 각각 56%와 103%의 생존률을 보임으로써 BCNU 5016의 내산성은 매우 뛰어나며, 담즙에 대한 내성은 상대적으로 낮음을 확인할 수 있었다.

Fig. 2.Survival rate of Paenibacillus sp. BCNU 5016 during 4 hr of exposure to different pH of PBS buffer. The symbols; ◆: pH 2.5, ■: pH 3.0, ▲: 4.0.

Fig. 3.Growth rates of Paenibacillus sp. BCNU 5016 in artificial bile acid. Bile acid tolerance was measured by cultivating BCNU 5016 in nutrient broth containing 0%, 0.3% and 0.6% oxgall for 24 hr at 37℃. The symbols; ◆: 0%, ■: 0.3%, ▲: 0.6%.

항균활성 및 장내 유해균에 대한 성장억제 활성

BCNU 5016은 그람양성균인 B. cereus와 S. aureus에 대하여 각각 12 mm, 15 mm의 억제환을 나타냈으며, 그람음성균인 E. coli, S. typhimurium 및 P. aeruginosa 대하여는 19-21 mm로 항균력이 뛰어난 것으로 조사되었다(Table 4, Fig. 4).

Table 4.Antimicrobial activity of Paenibacillus sp. BCNU 5016 against foodborne pathogens

Fig. 4.Antagonistic effect of Paenibacillus sp. BCNU 5016 on the growth of (A) B. cereus, (B) S. aureus, (C) E. coli, (D) K. pneumonia, (E) P. aeruginosa, (F) S. sonnei, (G) S. typhymurium, (H) V. alginolyticus, (I) V. parahaemolyticus after 24 hr of incubation.

또한 E. coli와 BCNU 5016을 10:10, 10:1의 비율로 혼합 배양시, E, coli의 생존률은 각각 2%, 74%로 나타나 동일한 비율로 배양시 E. coli에 대한 저해능이 매우 우수한 것으로 확인되었다. S. sonnei와 동시배양 결과는 S. sonnei의 생존률이 각각 79%, 89%로 나타났다. 따라서 Paenibacillus sp. BCNU 5016은 E. coli에 대해 보다 높은 저해능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(Fig 5).

Fig. 5.The growth inhibitory activity of Paenibacillus sp. BCNU 5016 using mixed cultures with E. coli (black bar) or S. sonnei (white bar).

세포표면 소수성 및 응집능력

BCNU 5016의 부착정도는 chloroform 첨가시 96.8%로 높은 부착능을 보였으며, p-xylene, hexadecane 그리고 ethylacetate에 대해서는 각각 17.2%, 31.6%, 19.8%로 세포표면의 소수성 정도는 다소 낮게 나타났다(Fig. 6). BCNU 5016과 L. monocytogenes, E. coli 그리고 S. aureus의 자가응집 정도는 각각 12.7%, 29.8%, 32.4%, 31.2%로 조사되었으며, 병원성 균주와의 공동응집능은 각각 22.7%, 20.4%, 20.0%로 나타났다. 따라서 BCNU 5016을 프로바이오틱스로서 섭취했을 때 병원성균이 장점막에 부착하는 것을 다소 저해할 수 있을 것으로 판단된다(Fig. 7).

Fig. 6.Surface hydrophobicity of Paenibacillus sp. BCNU 5016 against various solvents. Equal volumes of bacterial suspension (A0) and each of the solvents were mixed on a vortex for 2 min. The absorbance (600 nm) of the aqueous phase (A1) was monitored after 30 min of preincubation at room temperature. The percentage of microbial adhesion to the solvent was calculated as [(A0 - A1)/ A0]×100.

Fig. 7.Aggregation (black bar) and coaggregation (white bar) capacity of Paenibacillus sp. BCNU 5016 with foodborne pathogens. Bacterial suspensions of pure and mixed culture were monitored after 5 hr incubation at 37℃.

고 찰

현재 다수의 Bacillus sp. 균주는 프로바이오틱스로 개발되어 이용되고 있으며, Paenibacillus, Geobacillus, Anoxybacillus 및 Caldibacillus 등[15] 근연종들의 프로바이오틱스로의 가능성에 대해서도 연구가 이루어지고 있다.

본 연구는 2004년 ‘산업자원부 기술표준원 생물환경과’에서 가이드라인으로 제정한 ‘유산균의 안전성 검사방법’에 근거하여 유해대사산물 및 유해효소를 측정함으로써 안전성을 평가하였다. In vitro 조건에서 여러가지 유해인자에 대해 조사한 결과 Paenibacillus sp. BCNU 5016은 유해성이 없는 것으로 확인되었으며, 이는 유해효소인 β-glucuronidase, β-glucosidase, tryptophanase 및 urease를 생성하지 않는 균주를 쥐에 투여시 악영향을 끼치지 않았다는 연구결과가 보고된 바 있으므로[1], BCNU 5016도 안전한 것으로 판단할 수 있다.

그리고 항생제 내성을 가지는 균주는 장내 정상균총과 항생제 내성을 가지지 않는 균주에 항생제 내성유전자를 전달하여 항생제 내성을 유발할 수 있으므로 프로바이오틱스로서 적절하지 못하나[12], BCNU 5016은 SCAN 및 EFSA와 비교할 때 프로바이오틱스로서 적합한 감수성을 가지고 있으므로 안전한 것으로 판단된다. 또한 pH 2.5에서 4시간 배양시에도 90% 이상의 높은 내산성을 보였으며, 0.3% oxgall에서도 활발히 증식하여 내담즙산능 또한 뛰어난 것으로 확인되었다.

한편 B. subtilis는 E. coli 및 Salmonella choleraesuis를 동일한 비율로 혼합 배양한 결과 저해하지 못했으며, B. polyfermenticus는 E. coli와 S. choleraesuis를 각각 0.2%, 10%로 감소 시킨다고 보고하였다[10]. Paenibacillus sp. BCNU 5016은 E. coli를 98% 저해함으로써 병원균에 대한 저해능이 우수하다고 판단할 수 있으며, 이는 Bacillus 균주가 장내 유익한 lactoba-cilli의 균체량을 증가시키면서 유해한 E. coli의 균체량을 감소 시킨다는 기존의 보고와 유사함이 확인되었다[4]. 또한 소수성 및 응집능 조사 결과에서 BCNU 5016은 장점막에 붙어 장 질환을 유발하는 병원균을 경쟁적으로 떨어뜨리며 장내 병원성균의 증식을 억제함으로써 질병의 예방효과가 우수할 것으로 예상된다.

그러므로 BCNU 5016은 in vitro 조건에서 안전성, 안정성 및 병원균에 대한 길항능 등의 기능성을 가짐으로 프로바이오틱스로서의 가능성이 매우 높은 균주임이 확인되었다. 그러나 현재 프로바이오틱스 균주로 등재된 B. licheniformis가 식중독과 관련된 독소를 생산한다고 보고된 바 있기에, Paenibacillus sp. BCNU 5016 균주의 실용화를 위해서는 in vivo에서 안전성에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.