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Isolation and Identification of a Novel Anticancer Compound from Solanum nigrum

용규(Solanum nigrum)에서 HT29 세포에 대한 신규 항암 활성 단일 물질 분리

  • 윤희정 (동의대학교 블루바이오소재개발센터) ;
  • 정종헌 (동의대학교 자연과학대학 생명응용학과) ;
  • 현숙경 (동의대학교 블루바이오소재개발센터) ;
  • 김병우 (동의대학교 블루바이오소재개발센터) ;
  • 권현주 (동의대학교 블루바이오소재개발센터)
  • Received : 2013.12.02
  • Accepted : 2014.03.05
  • Published : 2014.03.30
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Abstract

To identify and isolate anticancer active compounds from Solanum nigrum, S. nigrum was extracted with MeOH and then fractionated with various organic solvents ($CH_2Cl_2$, EtOAc, n-BuOH, and $H_2O$). The cytotoxic effects of the MeOH extracts from S. nigrum and its organic solvent-soluble fractions were also tested in HT29 cells. All the MeOH extracts of S. nigrum and its organic-solvent extracts induced cytotoxicity in the HT29 cells. Among the extracts, $H_2O$ was the most effective. The $H_2O$ extract was purified further by repeated silica gel, Sephadex LH-20, Diaion HP- 20, and RP-18 column chromatography. An active anticancer compound, Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine, was isolated with a molecular weight of 416 and a molecular formula of $C_{28}H_{48}O_2$. Analysis of the cytotoxic effects of Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine on the HT29 cells compared to those of tomatine and tomatidine are similar in its structure, is higher than tomatidine above the 40 ${\mu}g/ml$ concentration, but lower than tomatine. This is the first study to describe the anticancer activity of Des-N-26-methylene-dihydrotomatidin, isolated from S. nigrum. Des-N-26- methylene-dihydrotomatidine seems to have potential as a natural bioactive compound.

용규(Solanum nigrum)에 함유된 여러 성분 중 항암 활성이 있는 물질을 분리 및 규명하고자 용규를 MeOH로 추출하고 이 추출물을 $CH_2Cl_2$, EtOAc, n-BuOH, $H_2O$로 유기용매 계통분획 하였다. 이 분획물 중 $H_2O$ 획분이 가장 뛰어난 세포 독성 효과를 보였으며 이를 다시 용매별($H_2O$, 40% MeOH, 60% MeOH, MeOH)로 Diaion HP-20 column chromatography하여 4개의 fraction으로 나누었다. 이 fraction 중 $H_2O$ fraction에서 가장 뛰어난 세포 독성효과를 보였으며 몇 차례의 column chromatography를 행하여 얻어진 활성 획분을 GC-MS 및 FAB-MS 분석하였다. 분자량이 416이었으며 GC-Mass를 통하여 library search를 행한 결과 분자식 $C_{28}H_{48}O_2$인 Des-N-26-methylenedihydrotomatidine으로 확인되었다. Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine과 비슷한 구조를 가지고 있는 tomatine과 tomatidine의 HT29 세포에 대한 세포독성효과를 확인한 결과, tomatine보다는 활성이 낮았으나 tomatidine 보다는 40 ${\mu}g/ml$ 이상의 농도에서 높은 세포독성 효과를 나타내었다. Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine은 지금까지 학계에 보고되어 있지 않은 물질로, 본 연구에서 최초로 용규에서 Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine을 분리하였고, 암세포에 대한 세포 독성 효과를 보고하였다. Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine의 정상세포에서의 세포 독성 및 작용 기전 등의 추가 연구를 통해 천연 생리 활성 물질 소재로 활용 가능할 것으로 사료된다.

Keywords

서 론

암 치료는 외과적 수술, 방사선 치료, 화학요법제, 생물요법제 등으로 이루어지나, 암의 재발 및 전이의 방지를 위해 화학요법제가 기본적으로 병용 치료된다[9]. 항암 화학요법은 약물, 즉 항암제를 사용하여 암을 치료하는 것으로, 항암제가 혈류를 따라 온 몸으로 돌면서 전신에 퍼져있는 암세포를 죽이기 때문에 전신치료라 한다. 이들 항암제들은 대부분 세포내 DNA의 복제, 전사 및 번역을 차단시키거나 세포 생존에 필수적인 단백질의 작용을 방해하여 그 효과를 나타낸다[9]. 따라서 증식을 위해 지속적인 DNA 복제가 일어나는 종양세포에 현저한 영향을 나타내고, 결과적으로 종양의 성장이 억제되는 것이다. 그러나 이러한 효과는 암세포 뿐 아니라 정상세포에도 동일한 효과가 작용하여 구토, 탈모, 설사, 면역력저하 등의 부작용이 발생한다[11]. 또한 암세포의 항암제에 대한 내성의 출현으로 암세포의 완전소멸에 심각한 문제를 발생시킨다. 또한 일단 내성이 발현되면 동일 기전의 항암제에 대해서도 내성을 가지게 되므로, 작용기전이 다른 항암제를 같이 투여함으로써 치료효과를 높이는 동시에 내성을 유발하지 않도록 하는 것이 항암제 치료의 기본이다[9]. 따라서, 부작용이 없으면서 항암 효과가 탁월한 항암제의 개발이 시급한 실정이고, 이를 위해 천연물 유래의 항암 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

천연물 신약이란 자연계에 존재하는 동물, 식물 및 미생물과 그 대사산물을 원료로 하여 제작된 신약을 의미하는 것으로, 대부분 고전적으로 사용되고 있는 생약이나 식품으로부터 얻으므로 유효성과 안전성이 입증되어 있다. 또한 이미 확보된 데이터베이스가 풍부해 합성신약보다 개발기간이 짧고 비용을 단축시킬 수 있다. 이러한 이유로 최근 천연물에서 신약을 개발하기 위한 연구가 지속되고 있고, 암, 감염, 대사질환, 아토피 등의 치료를 위해 사용되고 있다[3].

천연물로부터의 항암제 개발은 1962년 매자나무과 식물인 Podophyllum peltatum에서 분리한 podophyllotoxin의 유도체 연구에서 시작하여[8], 1971년 서양의 주목 Taxus brevifolia의 수피에서 taxol을 분리한 후 가속화되어[29], 현재 식물에서 vincristine, vinblastine, paclitaxel, irinotecan, 미생물에서 actinomycin, bleomycin, doxorubicin, rapamicin, 해양생물에서 citarabine, aplidine 등 다수의 항암제들이 식물 및 미생물, 해양생물과 식용작물 등의 천연물에서 분리되어 사용 중이거나 연구개발 중이다[1]. 식품의약품안전처에서 2012년에 발표한 국내 개발 항암제 허가 및 임상시험 동향에 의하면, 국내에서 개발된 항암제는 SK제약(주)의 제 3세대 백금착제 합성 항암제인 선플라주가 1993년에 최초로 국내 신약으로 승인된 후, 동화약품(주)의 방사선 의약품인 밀리칸주가 2001년에 간암 치료제로 승인받았고, 2003년에 난소암과 폐암 치료제로 종근당의 캄토벨주, 2012년에 일양약품의 슈펙트캡슐이 만성 골수성백혈병 치료제로 승인받아 시판되고 있다. 이들을 포함하여 지금까지 국내에서 허가된 항암제는 총 364품목으로, 이 중 바이오 및 천연물의약품은 21품목이고, 17건의 바이오 및 천연물의약품이 임상 시험 진행 중이다. 그러나 국내 개발 항암제는 합성의약품의 비중이 높아 바이오 및 천연물의약품에 대한 연구가 더 많이 이루어져야 한다.

따라서 본 연구에서는 천연물에서 항암활성 물질을 분리하기 위해 우리나라에서 고전적으로 사용되고 있는 한약재를 대상으로 인체 대장암 세포주인 HT29 세포에서 항암 효과를 나타내는 물질을 탐색하였고, 그 중 용규가 HT29 세포에 독성 효과를 나타냄을 확인하였다. 용규(Solanum nigrum)는 가지과 (Solanaceae)에 속하는 한해살이풀로서, 생약명이 용규(龍葵)이며, 고규(苦葵), 천가자(天茄子), 야가자(野茄子)라고도 한다. 또한 원재료명은 까마중으로 열매가 까맣게 익어 승려의 깍은 머리를 닮았다고 해서 붙여진 이름으로, 지역에 따라 가마중, 먹때깔, 먹딸, 개멀구, 깜뚜라지 등으로도 불린다. 용규의 전초에는 solanine, solamargine과 같은 여러 가지 alkaloid와 vitamin A와 C가 함유되어 있으며, 또한 saponin, asparagine, rutin, nicotine 및 carotene 등 다양한 성분을 포함하고 있다[4]. 용규의 약리작용으로는 간 보호, 신장 세포 보호, 중추신경계 진정, 항 위궤양, 항당뇨, 혈압 강하, 항산화, 항염증 작용 등이 보고되어 있다[2, 4, 12, 13, 19, 24-26]. 용규의 항암활성에 대한 연구는 직장암, 전립선암, 유방암, 자궁경부암, 난소암 등의 암세포주에 대한 항암 효과가 보고되어 있고, 이들은 용규에서 분리된 다당체, steroid alkaloid, solanine에 의한 효과이고 용규 물 추출물에 의한 in vivo 항암활성에 대한 연구도 보고되어있다[4, 14, 15, 17, 18, 20, 30].

본 연구에서는 HT29 세포에 독성효과를 나타내는 성분을 분리하기 위해 용규의 계통적 분획을 실시, 용규 메탄올 추출물과 각 분획물들의 항암활성을 평가하였으며, 효과가 나타난 분획물의 활성 성분을 규명하기 위해 반복적인 Silica gel, Sephadex LH-20, Diaion HP-20, 그리고 RP-18 column chromatography를 실시하였다. 그 결과, 지금까지 보고되지 않은 신규 항암 활성 단일 물질 Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine을 용규에서 분리하였고, 구조 분석 결과 유사 구조물질로 확인된 tomatine과 tomatidine의 항암 활성을 비교 검토하였기에 보고하고자 한다.

 

재료 및 방법

실험 재료

본 실험에서 사용한 용규(Solanum nigrum)는 삼흥건재약업사(서울)에서 구입하였다. 시료 추출용 유기용매는 1급 시약 (Ducksan reagent ＆ chemicals, Korea)으로 methanol, dichloromethan, ethyl acetate, n-butanol을 사용하였다. Tomatidine과 tomatine은 ChromaDex (Suite G, Irivine, CA, USA)에서 구입하였다.

세포 배양

인간 대장암 세포주인 HT29 세포는 ATCC (American type culture collection)에서 구입하였다. HT29 세포는 RPMI 1640 배지에 10％ (v/v)의 FBS (fetal bovine serum, Omega Scientific, Inc. Tarzana, CA, USA)와 0.1％ gentamycine을 첨가한 배지를 사용하였으며 37℃, 5％ CO2 세포 배양기에서 배양하였다.

세포독성 측정(Cytotoxicity assay)

용규 메탄올 추출물과 각 분획별 세포독성 효과는 Pre-Mixed WST-1 Cell Proliferation Assay System (Takara, Otsu, Shiga, Japan)을 이용하여 확인하였다. HT29 세포를 96 well plate에 5×104 cells/well의 농도로 seeding한 후 24시간 배양한 다음 용규 메탄올 추출물과 각 분획물을 초기농도 2,500 µg/ml의 농도로 well에 처리하여 단계 희석 하였고, 대조군은 0.1％ dimethyl sulfoxide를 처리하였다. 37℃에서 48시간 배양한 다음 WST-1 solution을 각 well에 20 µl씩 첨가하고 30분 반응 후 광학 농도를 효소면역측정 판독기(ELISA, Enzyme linked immunosorbent assay)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.

용규의 추출 및 유기용매 계통분획

건조한 용규 3 kg을 분쇄하여 환류 냉각기가 부착된 집기병에 담은 후 8 l의 메탄올을 넣어 75℃에서 3시간 동안 추출하였다. 그리고 추출액은 Whatman No. 2 paper (Whatman international Ltd., England)로 여과하였으며 rotary vacuum evaporator를 사용하여 45℃에서 감압 농축하였다. 위와 같은 방법으로 3회 반복하여 용규 메탄올 추출물을 수득하였다. 이하 용규 메탄올 추출물은 SNME (Solanum nigrum methanol extracts) 로 명명한다. SNME는 서로 극성을 달리하여 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH로 순차적으로 분획하였다. 각 분획물의 HT29 세포에 대한 세포 독성을 확인하고, 활성 분획물은 유효성분 분리에 사용하였다.

활성 성분의 분리 및 구조 결정

Column chromatography를 위한 column packing 물질은 Kieselgel 60 (Si gel, 70-230 mesh ASTM, Merck, Art. 7734), Sephadex LH-20 (bead size 20-100 µm, Supelco), RP-18 (LiChroprep® RP-18, 40-63 µm, Merck), 그리고 Diaion HP-20 (250-850 µm, Supelco)을 사용하였고, TLC plate는 Kieselgel 60 F254 (0.25 mm, precoated, Merck, Art. 5715)과 RP-18 F254s (Merck, Art.5685)를 사용하였으며, 발색은 50％ H2SO4 spray reagent를 사용하였다. TLC plate에 의한 화합물 검색시 UV lamp (Model ENF-240C, Spectroline, USA)로 장파장(365 nm), 단파장(254 nm)에서 각각 관찰하였다. FAB-MS는 JEOL JMS-700 mass spectrometer를 사용하였고 GC-MS는 320-MS (Bruker, USA)를 사용하였다.

 

결과 및 고찰

유기용매 계통분획법에 따른 분획별 수득률과 각 분획물의 세포 독성 효과

용규의 메탄올 추출과 각 용매별 분획과정 및 각 분획물의 세포독성 효과를 나타내는 IC50 값은 Fig. 1에 나타내었다. 건조한 용규 3 kg을 분쇄하여 환류 냉각기가 부착된 집기병에 담은 후 8 l의 MeOH을 넣고 75℃에서 3시간 동안 추출하였다. 그리고 추출액은 Whatman No. 2 (Whatman international Ltd., England)로 여과한 후 rotary vacuum evaporator를 사용하여 45℃에서 농축하였다. 위와 같은 방법으로 3회 반복하여 SNME 총 231.1 g을 얻었다. 이후 SNME를 H2O : MeOH (9:1, v/v)의 혼합 용매로 녹인 다음 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH의 순서로 분획하여 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH 및 H2O 분획물을 각각 104.2 g, 3.9 g, 24.2 g 및 98.74 g 수득하였다. SNME와 각 분획물의 HT29 세포에 대한 세포 독성 효과를 PreMixed WST-1 Cell Proliferation Assay System을 이용하여 확인하였다. WST-1 solution은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 존재하는 succinate dehydrogenase에 의해 생성된 수용성 formazan의 양을 측정하여 세포의 생존율을 확인하는 시약으로, 450 nm에서 배색 정량한 결과 SNME와 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH 및 H2O 분획물 모두 세포 독성 효과를 나타내었다(Fig. 1B). 50％ 정도의 세포 생존율을 나타내는 IC50값은 SNME의 경우 59.2 µg/ml이었고, CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH, H2O 분획물은 각각 632, 2500, 1750, 71.2 µg/ml로 나타나 H2O 분획물이 가장 높은 세포 독성을 나타내었다. 따라서 추출물의 양이 가장 많고 희소가치가 있는 H2O 분획물을 선택하여 활성 성분을 분리하고자 하였다.

Fig. 1.Extracted schematic of Solanum nigrum, and cytotoxicity of its extracts on HT29 cells. (A) Extraction and fractionation of Solanum nigrum (B) Cytotoxicity of the methanol extract and each fractions of Solanum nigrum on HT29 cells. Cytotoxic activity detected by WST-1 assay. The cells were exposed to various concentration of indicated extract and each fractions for 24 hr. WST-1 solution was added to each well and optical density was read with an ELISA reader at 490 nm. IC50 value of each fractions were presented.

H2O 분획물의 성분 분리 및 세포 독성 효과

SNME의 H2O 분획물 98.74 g을 Diaion HP-20 column chromatography를 이용하여 H2O, 40％ MeOH, 60％ MeOH, 그리고 100％ MeOH로 용출하여 4개의 분획물로 나누었고 각각 80.3 g, 1.5 g, 4.3 g, 그리고 3.7 g을 수득하였다(Fig. 1A). 이후 각 분획물의 HT29 세포에 대한 세포 독성효과를 확인한 결과(Fig. 1B), 모든 분획물에서 세포 독성 효과가 나타났다. 각 분획물의 IC50값을 비교해보면 100％ H2O와 100％ MeOH 분획물이 각각 40.7 µg/ml, 41.4 µg/ml로 비슷한 세포독성 효과가 나타났으나, 본 실험에서는 양이 가장 많은 H2O fraction을 이용하여 다시 성분 분리를 행하였다. 이후, 용규 메탄올 추출물의 H2O 분획물에서 분리한 H2O fraction을 Fr. H-H로 명명하였다.

Fr. H-H 의 유효활성 성분 분리 및 구조 결정

세포 독성 효과를 나타내는 Fr. H-H에서 활성 성분의 분리 과정은 Fig. 2에 나타내었다. Fr. H-H 80.3 g을 전개 용매 EtOAc　:　MeOH　:　H2O (21:8:2~21:12:3)로 silica gel column chromatography하여 7개의 fraction (Fr. H-H-1~7)으로 나누었다. H-H-1~7의 모든 fraction은 HT29 세포에서 세포독성효과를 나타내었고, 그 중 Fr. H-H-2가 가장 높은 활성을 나타내어(data not shown), Fr. H-H-2 (6.5 g)를 전개용매 EtOAc : MeOH : H2O (21:8:2~21:12:3)로 silica gel column chromatography하여 7개의 fraction (Fr. H-H-2-1~7)으로 나누었다. 이 가운데 세포독성 효과가 있는 Fr. H- H-2-4 (0.12 g)를 전개용매 50％ MeOH로 Sephadex LH-20 column chromatography하여 3개의 fraction (Fr. H-H-2-4-1~3)을 얻었고, TLC로 확인한 결과 단일 물질인 것으로 나타난 Fr. H-H-2-4-3을 감압 농축하여 흰색 침상 결정 0.076 g을 획득하였다. 이 물질의 분자량 및 구조를 알아보기 위하여 FAB- MS와 GC-MS를 이용하였다. FAB-MS 측정 결과 분자량은 416이었고(Fig. 3A) GC-MS를 시행하여 library search를 행한 결과(Fig. 3B) 분자식이 C28H48O2인 Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine으로 확인되었다.

Fig. 2.Purification process of active compound from H2O-H2O fraction of Methanol extracts of Solanum nigrum.

Fig. 3.FAB-Mass spectrum and GC-Mass library search of active compound. (A) FAB-Mass spectrum (B) GC-Mass library search.

Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine과 구조 유사물질 tomatine, tomatidine의 세포 독성 효과

Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine은 지금까지 학계에 보고되어 있지 않은 물질로, 비슷한 구조의 물질을 library search한 결과 tomatidine 및 tomatine을 확인할 수 있었다(Fig. 4). Tomatidine 및 tomatine은 토마토에 존재하는 steroid 골격을 가진 tomato glycoalkaloid (TGA)의 화학 구성 물질로 생물체가 나타내는 특이 기능 물질이라고 알려져 있다[16]. TGA의 생물학적 특성에 관해서는 명확하지 않으나 TGA는 미생물이나 곤충에게 독성으로 작용해 식물이 외부로부터 자신을 보호하는 침해방지 역할을 하는 것으로 알려져 있다[28]. TGA의 화학구성물 중 tomatine은 녹색 토마토에 다량 존재하고 척추동물의 항염증 효과와 인체 암세포에 대한 약제 내성(multidrug resistance) 억제 효과 등 항암 화학 요법에도 효과가 있는 것으로 보고되고 있다[9]. 그 외에도 위암, 폐암 등을 예방하는 것으로 알려져 있으며 뇌세포기능 촉진 작용, 식욕증진 작용, 피부 신진대사 촉진 작용, 혈압 강하 작용, 혈압순환 개선작용, 피로 회복 작용 등의 생리 활성 및 효능이 있음이 알려지고 있다[5].

Fig. 4.Structure of active compound and its analogues. (A) Des-N- 26-Methylene-dihydrotomatidine (B) Tomatidine (C) Tomatine.

또한 가지과(Solanaceae)에 속하는 식물의 2차 대사산물인 steroid alkaloids는 대부분 배당체로서 존재하며 식물의 종류에 따라 분류, solanum alkaloid (가지과 Solanaceae Solanum 속; solanin, tomatine)와 veratrum alkaloid (백합과 Liliaceae Veratrum속의 jervine, protoveratrine)가 알려져 있다[21]. Tomatine은 가지과 Solanaceae에 속하는 토마토 전초에 함유되어 있으며, 가수분해하면 tetrasaccharide 잔기인 lycotetraose, 즉 glucose 2분자, xylose, galactose 각 1분자와 aglycone인 tomatidine으로 구성되어있다. 그리고 용규에서 분리한 Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine과의 구조적 차이를 보면 26번 위치에 질소 대신 methylene기로 치환되어 alkaloid의 특성은 지니지 않지만 steroid 골격을 가지고 있는 활성화합물임을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 분리한 Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine과 비슷한 기본 구조를 가지고 있는 tomatidine과 tomatine을 사용하여 HT29 세포에서의 세포독성 효과를 비교한 결과(Fig. 5), Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine은 항암효과가 알려져 있는 tomatine 보다는 활성이 낮았다. Tomatidine의 경우 40 µg/ml 농도에서 약 68％의 세포 생존율을 나타냈으나, Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine은 동일 농도에서 약 46％의 세포 생존율을 나타내 40 µg/ml보다 높은 농도에서는 tomatidine보다 높은 세포독성 효과를 나타내었다. 이는 Friedman에 의한 aglycone 또는 가수분해물 보다 배당체가 보통 활성이 더 높다는 보고와 일치하였다[7, 9, 10].

Fig. 5.Cytotoxic effects of Des-N-26-Methylene-dihydrotomatidine (A), tomatidine (B) and tomatine (C) on HT29 cells detected by WST-1 assay. The cells were exposed to various concentrations of indicated chemicals for 48 hr.

용규는 다양한 암세포주에서 항암효과를 가지고 있는 것으로 보고되어 있다. 최근 보고에 의하면 용규의 polyphenolic extracts가 몇몇 전립선암 세포주에서 apoptosis 및 세포 주기 정지를 유도하나 정상 전립선 상피 세포에는 영향을 미치지 않았고[22], 또 다른 보고에서는 용규 메탄올 추출물이 자궁경부암 세포주 HeLa에서 세포 독성 효과를 보였으나 정상 신장세포인 Vero cell에서는 더 낮은 독성 효과를 보였다[23]. 또한, 용규의 hydro-alcoholic 추출물에 의한 유사한 결과도 보고되어 있다[27].

본 연구에서 추출한 Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine은 용규 메탄올 추출물(231.1 g)로부터 0.076 g의 활성 분획물을 얻어, 수율은 0.03％로 본 성분의 보다 체계적인 활성 검토를 위해서는 수율을 높여 분리 정제하는 방법의 검토와 본 성분의 정상 세포에서의 독성 등을 파악하는 것이 더욱 중요하며 이후 연구가 필요하다고 사료된다. 하지만 본 논문에서 는 용규(Solanum nigrum)에서 암세포에 독성이 있는 물질 Des-N-26-methylene-dihydrotomatidine을 분리하여 구조적으로 유사한 물질과의 활성 차이에 대해 검토하였으며 이 결과는 기초 연구 자료로서 활용 가능할 것으로 사료된다.

References

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