재료 및 방법

균주 분리원

본 연구에 사용된 전통장류는 강원도에서 전통적인 방법으로 제조되어 판매되고 있는 된장 10점, 고추장 5점, 막장 5점, 간장 5점, 그리고 청국장 5점 등 총 30점을 수집하여 사용하였다.

균주분리

생리식염수 90 ml에 수집한 장류 시료 10 g을 넣어 교반기 (hb-201SF, Hanbaek Scientific, Korea)로 10시간 진탕한 후 정치시키고 상등액 100 μl를 chloramphenicol (100 μg/ml)이 첨가된 YEPD (1% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) glucose) 고체배지에 도말하여 30°C에서 48시간 배양한 후 단일집락을 형성하는 균주를 1차 선발하였다.

혈전용해 활성 측정

효모 균주의 혈전분해 효소 활성은 Astrup과 Mullerttz의 방법 [1]을 변형하여 측정하였다. Fibrinogen을 최종농도가 0.3% (w/v)가 되도록 PBS 완충액(0.1 M, pH 7.4)에 용해시켜 평판에 부은 후 1.5% (w/v) agarose 용액을 동량 첨가하여 혼합하였고 여기에 thrombin (20 U, Sigma-Aldrich, USA)을 100 μl 첨가하여 상온에서 정치한 후 균주 배양액 20 μl를 분주하여 paper disk 방법[10]으로 활성을 측정하였다. 단백질은 Bradford protein assay plus kit (GenDEPOT, USA)을 이용하여 정량하였으며, 양성 대조구로는 plasmin (2 U/mg protein, Sigma-Aldrich)을 사용하였고, 혈전분해 활성이 없는 S. cerevisiae BY4742 [17] 균주 배양액을 음성대조구로 각각 20 μl를 분주하여 사용하였다. 각 균주가 나타내는 혈전용해 활성은 아래 식과 같이 plasmin이 나타내는 혈전용해 활성의 상대활성으로 정의하였다.

효모 염색체 DNA 분리

효모 균주를 200 ml의 YEPD 배지에서 12시간 동안 진탕 배양한 후 원심분리(1,200 × g, 5분)하여 회수한 균체를 STES 완충용액(0.5 M NaCl, 0.2 M Tris-HCl, 001 M EDTA, 1% sodium dodecyl sulfate (SDS), pH 7.6)으로 세척하고 30 μl의 STES 완충용액으로 균체를 현탁하였다. 동일부피의 glass bead (Sigma-Aldrich)를 첨가하고 microtube mixer (Advance, Japan)로 5분간 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄액에 200 μl의 TE (0.01 M Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) 완충용액과 동량의 phenol/chloroform을 첨가하고 교반한 후 4°C에서 원심분리 (1,200 × g, 10분)하여 상층액을 회수하였다. 3 M sodium acetate (pH 5.2) 용액 30 μl와 900 μl의 ethanol을 첨가하고 원심분리한 후 회수한 침전물을 70% ethanol로 세척하였다. RNaseA (1 μg/ml, Thermo Scientific, USA)가 첨가된 TE 완충용액을 100 μl 첨가하여 염색체 DNA를 얻었다[26].

균주동정

분리된 효모균주의 동정을 위하여 ITS1(5'-TCCGTAGGT GAACCTGCGG-3')과 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') 프라이머를 사용하여 18S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다[9]. 염색체 DNA (10 ng)를 주형으로 사용하고 1.25 U Taq polymerase (Bioneer, Korea), 10 pmol primers, 0.2mM dNTPs와 10배 농축반응용액(10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 105 mM MgCl2, pH 8.3)을 첨가하고 최종 부피를 50 μl로 하여 94°C에서 3분간 반응시키고 94°C에서 1분, 60°C에서 30초, 72°C에서 1분 반응을 28회 수행한 후, 최종적으로 72°C에서 10분간 반응시켰다. PCR 반응산물은 1.5% agarose gel을 사용하는 전기영동장치를 이용하여 분석하였고, 약 400 bp의 증폭산물의 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 제공하는 Blast 프로그램을 이용하여 염기서열을 비교하여 계통분류학적 유연 관계를 분석한 후, Neighbor-joining method [8]을 사용하여 계통도를 작성하였다. 분리된 균주의 탄소원 이용 특성은 API 20C AUX kit (BioMèrieux, France)으로 조사하였다.

주사전자현미경(SEM)

분리된 균주의 형태학적 특성을 확인하기 위하여 균주배양액을 원심분리(10,000 × g, 2분, 4°C) 한 후 상층액을 제거하 고 생리식염수로 2회 세척하였다. 주사현미경 관찰을 위한 전처리는 0.1 M sodium phosphate 완충액(pH 7.4)으로 제조한 2.5% glutaraldehyde (TAAB Laboratoties Equipment Ltd., UK) 용액으로 세포를 3시간 고정시킨 후 같은 완충액으로 2회 세척한 후 1% osmium tetroxide (Sigma-Aldrich) 용액으로 30분간 고정하였다[31]. 농도구배 에탄올(50-100%)로 각각 5분씩 탈수 후 100% hexamethyldisilazane (Sigma-Aldrich)으로 완전히 탈수한 후 건조시켰다. 전처리한 균주는 주사전자현미경(JSM-35CF, JEOL, Japan)을 사용하여 20,000배 배율로 관찰하였다.

균주의 생육특성

혈전용해 활성이 우수한 효모균주를 YEPD 배지가 포함된 20 L 발효조에서 24시간 동안 다양한 온도(24-40°C)에서 배양한 후 균체농도(균체수)를 측정하였다. 무기염류가 효모균주의 성장에 미치는 영향도 같은 조건에서 수행하였다. 30°C에서 12시간 동안 배양한 종배양액은 초기 세포흡광도(OD600)가 0.1이 되도록 접종하였고 배양 중 교반속도는 400 rpm으로 고정하였고 pH와 용존산소는 조절하지 않았다.

결과 및 고찰

혈전용해 활성이 우수한 효모 균주선발

항생제인 chloramphenicol이 함유된 YEDP 고체배지에서 1차 분리된 효모균주 중 혈전용해 활성이 우수한 균주를 선발하기 위하여 효모 균주를 YEPD 배지에서 12시간 배양 한 후 원심분리하고 상층액을 조효소액으로 사용하여 혈전용해 활성을 측정하였다(Fig. 1A). 혈전용해활성의 상대적 비교를 위해서 단백질 농도를 측정하여 양성 대조구 농도로 희석한 후 각각 20 μl를 분주하여 사용하였다. 각각 된장과 간장으로부터 분리된 효모인 AFY-1과 KA3Y1균주는 각각 3.5 U/mg protein, 2.2 U/mg protein의 혈전용해 활성을 나타내었다 (Table 1). 대조구로 사용한 실험실 균주인 S. cerevisiae BY4742는 혈전용해 활성을 나타내지 않았다.

Fig. 1.Fibrinolytic activities of the yeast strains (A) isolated from fermented soybean and SEM (scanning electron microscope) image of the AFY-1 strain (B). P: Plasmin (1.0 U), N: water, 1: C11Y14, 2: KA3Y2, 3: M24Y1, 4: M1Y2, 5: M3Y1, 6: KA3Y1, 7: AFY-1, 8: S. cerevisiae BY4742.

Table 1.a)Data are averages and standard errors from three independent measurements.b)ND: not detected.

효모 균주의 동정

강원 전통장류로부터 분리된 혈전분해 효소 활성이 있는 효모균주 6점을 동정하기 위하여 18S rRNA 유전자 염기서열 분석결과를 바탕으로 기존 표준균주들과 상동성을 검토한 결과 C11Y14, KA3Y2, KA3Y1, M1Y2 및 M3Y1로 각각 명명된 균주는 Zygosaccharomyces rouxii (100%), M24Y1로 명명된 균주는 Candida sp. (100%), AFY-1로 명명된 균주는 Saccharomycetales sp. (99%)와 가장 높은 상동성을 나타내었다. 이 중 혈전용해 활성이 가장 우수한 AFY-1 균주는 탄소원 대사특성(Table 2) 및 주사전자현미경 관찰을 통하여 형태학적 특성(Fig. 1B)을 검토한 결과 Saccharomycetales sp.로 최종 동정되었으며(Fig. 2) 농촌진흥청 농업유전자원센터에 기탁하였다(균주기탁번호: KACC93155P).

Table 2.Characteristics of carbon source utilization of the Saccharomycetales sp. AFY-1 strain.

Fig. 2.The phylogenetic tree of the 18S rRNA sequence of Saccharomycetales sp. and other homologs from other yeasts. The numbers on the nodes correspond to the bootstrap percentages based on 1,000 pseudoreplicates. The bar denotes the relative branch length. 18S rRNA gene sequences are identified by their GenBank accession number in parentheses.

균주의 생육특성

혈전용해 활성이 가장 우수한 AFY-1 균주의 대량배양을 위해 균주의 생육특성을 조사하였다. 배양온도가 AFY-1 균주의 생육에 미치는 영향을 조사하기 위하여 24-40°C의 온도에서 24시간 배양한 후 균체농도를 측정한 결과 32°C에서 균체 농도는 9.65 ± 0.24 log cfu/ml로 가장 우수한 균체성장을 나타내었다(Table 3). 무기염류가 균체성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여 K2HPO4, KH2PO4, 및 MgSO4·7H2O을 0-0.2% (w/v)의 농도로 첨가하여 32°C에서 24시간 동안 배양한 후 균체농도를 측정한 결과 K2HPO4 및 KH2PO4는 0.2% (w/v) 농도에서, MgSO4·7H2O는 0.15% (w/v)에서 각각 균체성장이 증가하였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다(Table 4).

Table 3.a)Cells were grown at each temperature for 24 h. Initial medium acidity was adjusted to pH 5.0. Data are averages and standard errors from three separate cultivations.

Table 4.a)Data are averages and standard errors from three separate cultivations grown for 24 h. Initial medium acidity was adjusted to pH 5.0 after addition of each salt.

기존의 전통발효 식품 유래 미생물 중 B. subtilis의 경우 37°C에서 Na2HPO4를 0.05% (w/v) 첨가하였을 때 1.5배 높은 혈전용해 효소 활성을 나타냈으며[5], B. licheniformis의 경우 CoCl2·6H2O, ZnCl2, HgCl2, FeSo4·7H2O, AgNO3과 같은 무기염류는 균체의 생육을 저해하는 것으로 나타났다[34]. 현재까지 우리나라를 포함한 일본, 중국 등에서 콩을 이용한 발효식품의 혈전용해능 등 다양한 생리기능성이 보고되고 있으며[3], 특히 태국의 콩 발효식품에서 분리한 B. licheniformis와 B. subtilis 등이 알레르기를 감소시킨다는 연구결과도 최근 보고된 바 있다[30]. 또한 전통장류에서 분리한 균주가 분비하는 혈전용해 효소의 특성에 관한 연구도 활발히 진행되고 있으며 균주 배양 시 첨가된 배지로 첨가된 질소원, 탄소원 등의 종류에 따라 혈전용해 활성이 변화된다는 보고도 있다[33].

전통식품 유래의 혈전용해 활성 미생물에 대한 연구는 지속적으로 이루어져 왔으나 대부분 Bacillus나 곰팡이에 국한되어 있었다[12, 13]. 본 연구에서 전통 장류로부터 혈전용해능이 우수한 효모를 분리·확보함으로써 장류의 명품화 및 제조공정의 과학화에 기여할 것으로 사료된다.