서 론

蛇床子는 대한약전외한약(생약)규격집에서 산형과(Umbelliferae)에 속한 일년생 초본인 벌사상자 Cnidium monieri (L). Cussion 또는 사상자 Torilis japonica Decandolle의 열매로 기록되어 있다1).

벌사상자 C. monnieri (L.) Cusson는 산형과에 속한 갯사상자속(Cnidium Cuss.)의 이년생 초본이며, 사상자 T. japonica (HOUTT.) DC.는 산형과에 속한 사상자속(Torilis Spreng)의 이년생 초본으로 우리나라에서는 蛇床子로 사용되고 있다2).

그러나 중국에서는 벌사상자 C. monieri (L). Cussion의 식물명을 蛇床으로 기록하여 한약명 蛇床子의 기원식물로 규정하고 있으며, 사상자 T. japonica Decandolle의 식물명을 小窃衣로 기록하여 한약명 窃衣의 기원식물로 구분하여 사용하고 있다3).

蛇床子는 性溫하고 味辛苦하며 脾經과 腎經으로 歸經한다. 溫腎壯陽의 효능이 있어서 男子의 陽痿, 女子의 子宮寒 不姙, 寒濕帶下를 치료하고 燥濕殺蟲, 祛風止痒의 효능으로 陰囊濕痒, 陰痒腫痛, 風濕痹痛, 濕瘡疥癬을 치료한다4). 蛇床子의 불임과 관련된 문헌으로,『神農本草經』에서 "男子 陰痿濕痒"이라 기재되었고, 『名醫別錄』에서 "男子陰强, 令人有子"로 기재되어 있다5).

窃衣는 性平하고 味苦辛하며 脾經과 大腸經으로 歸經한다. 殺蟲止瀉, 收濕止痒의 효능으로 蟲積腹痛, 泄痢, 瘡瘍潰爛, 陰痒帶下, 風濕疹의 主治 작용이 있다3).

蛇床子는 『千金要方』에서 免絲子, 蛇床子, 五味子를 等分한 天雄丸에 배오되어 陽痿不起한 증상을 치료하였다. 반면 窃衣는 『福建藥物志』에서 皮膚瘙痒症에 사용된 기록만 남아 있다3).

벌사상자 C. monnieri (L.) Cusson는 항알러지 작용, 남성보양작용, 항박테리아작용의 효과가 알려져 있으며6), 한편 사상자 T. japonica (HOUTT.) DC.도 멜라닌 형성 억제 효과가 보고되었다7). 현재 벌사상자 C. monnieri (L.) Cusson에 대한 실험연구로는 강 등8)은 벌사상자 추출물의 DPPH 활성에 대하여 蛇床子의 항산화 효과에 대해 밝혔으며, Chiou 등9)에 의해 벌사상자 추출물이 토끼의 음경해면체를 혈류량을 증가시킨다고 보고하였다. 사상자 T. japonica (HOUTT.) DC.에 대한 실험연구로는 박 등10)이 사상자가 testosterone 5 alpha-reductase를 저해한다고 보고하였다.

그러나 한국에서 벌사상자 C. monnieri (L.) Cusson와 사상자 T. japonica (HOUTT.) DC.가 혼용되고 있는 실정에서 벌사상자와 사상자의 남성생식세포에 미치는 효과를 비교연구한 것은 아직 보고된 바 없다. 이에 벌사상자 추출물 Cnidii Fructus (CF)과 사상자의 추출물 Torilis Fructus (TF)을 이용하여 DPPH 방법으로 항산화효과를 측정하였고, 남성불임에 미치는 기전을 비교 연구하고자 Leydig cell에 대한 cell viability, hydrogen peroxide에 의해 유도된 cytotoxicity, superoxide dismutase (SOD) 및 catalase activity를 각각 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

실 험

1. 재료 및 기기

1) 약재

본 실험에서 사용된 벌사상자 C. monnieri (L.) Cusson 열매는 중국산으로, 사상자 T. japonica (HOUTT.) DC. 열매는 한국산으로 정도생약을 통하여 구입하여, 경희대학교 처방제형학 교실에서 외부형태를 비교 조사하여 확인한 후 사용하였으며, 일부는 경희대학교 한의과대학 처방제형학 교실에 보관하였다.

2) 세포주

실험에 사용된 세포주는 TM3 (Leydig cell, mouse)로서 America Type Culture Collection (ATCC, USA)에서 구입하였다. 이 세포주는 고환 내 간질조직 (interstitial tissue)에 있는 Leydig cell에 속한다.

3) 시약 및 기기

본 실험을 위해서 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH, Sigma, USA), ascorbic acid (Sigma, USA), fetal bovine serum (FBS; GIBCO BRL, USA), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; GIBCO BRL, USA), trypsin-EDTA (GIBCO BRL, USA), ethanol 99.9% (Duksan, Korea), tetrazolium salt 3, [4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT; Sigma, USA), dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma, USA), hydrogen peroxide (Sigma, USA), n-butanol (Sigma, USA), pyridine (Sigma, USA), SOD enzyme (Sigma, USA) 등이 사용되었다. 본 실험에 사용된 기기는 rotary evaporator (Eyela, Japan), freeze dryer (Cooling & Heating Systems, Korea), deep freezer (Revco, USA), microplate spectrophotometer (Molecular Devices, USA), CO2 incubator (Sanyo, Japan) 등이다.

2. 실험 방법

1) 시료의 제조

벌사상자 C. monnieri (L.) Cusson 열매 300 g, 사상자 T. japonica (HOUTT.) DC. 열매 300 g을 정확하게 중량을 측정한 뒤 환류추출기에 각각 1차 증류수 6,000 ml와 함께 넣은 뒤 90 분 간 냉침하고, 탕액이 끓는 시점으로부터 90분 동안 가열하여 추출하고, filter paper로 감압 여과한 여과액을 rotary vacuum evaporator를 이용하여 농축액을 얻었다. 각각의 농축액을 동결건조기를 이용하여 건조한 분말을 시료로 사용하였다. 벌사상자 추출물 Cnidii Fructus (CF)로 표시하며 동결건조 추출물은 54 g을 얻었으며, 수율은 18%이었다. 사상자의 추출물 Torilis Fructus (TF)로 표시하며 동결건조 추출물은 63 g을 얻었으며, 수율은 21%이었다.

2) 세포 배양

Leydig cell line은 37℃, 5% CO2 조건에서 10% FBS, penicillin (100 μg/ml), streptomycin (100 μg/ml)이 첨가된 DMEM 배지로 배양되었다. Leydig cell은 75 ㎠ flask (Falcon, USA)에서 충분히 증식된 후 배양 3일 간격으로 배양세포 표면을 phosphate buffered saline (PBS) 용액으로 2회 씻어준 후 50 ml flask 당 1 ml의 0.25% trypsin-EDTA 용액을 넣고 실온에서 1 분간 처리한 다음 trypsin용액을 버리고 37℃에서 5분간 보관하여 세포를 탈착하여 계대 배양하였다. 탈착된 세포는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배양액 10 ml에 부유시킨 다음 새로운 배양용기에 옮겨 1 : 20의 split ratio로 CO2 배양기 (37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.

3) DPPH radical 소거 작용의 측정

DPPH radical scavenging activity를 알아보기 위하여 Chang 등11)의 방법을 응용하였다. 동결 건조된 시료를 증류수에 녹여서 1, 5, 10, 50, 100, 500, 1,000 μg/ml의 농도로 시액을 제조하였다. 양성 대조군으로 시료와 같은 농도의 ascorbic acid를 사용하였다. 96-well microplate (Corning, USA)에 ethanol에 녹인 0.1 mM DPPH와 각 농도의 시액을 동량 첨가한 후 잘 흔들어 섞어 준 후, 실온에서 30 분간 방치한 후 microplate spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. Radical scavenging activity는 다음 공식으로 계산되었다. DPPH radical scavenging activity (%) = [(AB-AT)/AB] × 100, AB; absorbance of blank sample, AT; absorbance of tested extract solution

4) Cell viability 측정

Leydig cell의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위하여 Mosmann 등12)의 방법을 응용하였다. 96 well plate에 1×105 cells/ml의 cell을 100 μl씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 PBS 용액으로 씻어주었다. 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료 1, 5, 10, 50, 100 μg/ml을 각 well에 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나기 4 시간 전에 PBS에 녹인 5 mg/ml MTT를 20 μl씩 각 well에 처리한 후 알루미늄 호일로 차광시킨 후 나머지 시간 동안 같은 조건에서 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후 DMSO를 100 μl 처리한 후 37℃에서 2 시간 방치 후 microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. Cell viability는 다음 공식으로 계산되었다. Cell viability(%) = 100×AT/AC, AC; absorbance of control, AT; absorbance of tested extract solution

5) Hydrogen peroxide-induced cytotoxicity 측정

Hydrogen peroxide에 의해 유도된 cytotoxicity에 대한 보호효과를 알아보기 위해 Mosmann 등12)의 MTT test를 응용하여 다음과 같이 실험하였다. 96 well plate에 1×105 cells/ml의 cell을 100 μl씩 넣고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 PBS 용액으로 씻어주었다. PBS에 녹인 각각의 시료 1, 5, 10, 50, 100 μg/ml과 FBS free DMEM에 녹인 50 μM H2O2 을 각각의 well에 처리한 후 4시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 배지를 버리고 PBS로 세척한 후 PBS에 녹인 5 mg/ml MTT 20 μl와 FBS free DMEM 200 μl을 각 well에 처리한 후 알루미늄호일로 차광한 뒤 4 시간 동안 같은 조건에서 배양하였다. 배양액을 모두 제거한 후 DMSO를 200 μl 처리한 후 37℃에서 2 시간 방치 후 microplate spectrophotometer를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

6) Superoxide dismutase (SOD) 활성도 측정

Leydig cell에 hydrogen peroxide를 처리한 후 시료를 처리하여 superoxide dismutase (SOD) 활성도에 미치는 영향을 Crapo 등13)의 방법에 따라 측정하였다. 100 mm tissue culture dish (BD Falcon, USA)에 10% FBS, penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml)이 첨가된 DMEM 배지에 현탁된 3×105 cells/ml의 cell을 8 ml 씩 넣었다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1X PBS 용액으로 씻어주었다. 1X PBS에 녹인 각각의 시료 1, 5, 10, 50, 100 μg/ml과 FBS free DMEM에 녹인 50 μM H2O2을 각각의 well에 처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 세포를 1X PBS로 2 회 수세한 후 lysis buffer를 첨가하고 스크랩퍼를 이용하여 긁어냈다. 이것을 1.5 ml의 eppendorf tube에 담아 12,000 × g에서 10 분간 원심분리 하여 상층액을 취하고 상층액 중의 1 μl를 취해 Bradford's method14)로 단백질을 정량하였다. 50 ml cornical tube에 0.1 M Na2HPO4, 0.1 M NaH2PO4, 3차 증류수에 EDTA 0.1 M 되도록 첨가하여 pH 7.8의 50 mM phosphate buffer (PB)를 만든 후 0.1 N NaOH에 5 μM xanthine을 녹여주고, 1 ml PB에 cytochrome C를 첨가하여 solution A를 제조하였다. 또한 0.1 mM EDTA가 첨가된 50 mM phosphate buffer에 0.2 μ/ml xanthine oxidase을 넣어 solution B를 제조하였다. solution A 870 μl와 농도를 맞춘 sample 20 μl와 solution B 20 μl를 섞은 후 550 nm에서 3 분 동안의 흡광도 변화를 측정하였다. 시료중의 SOD 활성은 0.05-12.5 units/mg SOD protein을 사용하여 만든 표준곡선을 이용하여 산출하였다. SOD 활성도 1 unit은 동일한 반응 조건하에서 3 분 동안 측정하여 chromogen의 생성을 50% 감소시키는 SOD양으로 정하였다.

7) Catalase 활성도 측정

Leydig cell에 hydrogen peroxide를 처리한 후 시료를 처리하여 catalase 활성도를 Aebi 등15)의 방법에 따라 측정하였다. 100 mm tissue culture dish (BD Falcon, USA)에 10% FBS, penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 μg/ml)이 첨가된 DMEM 배지에 현탁된 3×105 cells/ml의 cell을 8 ml 씩 넣었다. 37℃, 5% CO2 incubator에서 24 시간동안 배양한 후 배지를 버리고 배양세포 표면을 1X PBS 용액으로 씻어주었다. 1X PBS에 녹인 각각의 시료 1, 5, 10, 50, 100 μg/ml과 FBS free DMEM에 녹인 50 μM H2O2을 각각의 well에 동시처리하고 24 시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 세포를 1X PBS로 2 회 수세한 후 lysis buffer를 첨가하고 스크랩퍼를 이용하여 긁어냈다. 이것을 1.5 ml의 eppendorf tube에 담아 12,000 × g에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 취하고 상층액 중의 1 μl를 취해 Bradford's method14)로 단백질을 정량하였다. 50 ml cornical tube에 0.1 M Na2HPO4, 0.1 M NaH2PO4, 3차 증류수를 넣어 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0) 제조한 후 H2O2를 첨가한 후 0.015 M H2O2 in 0.01 M phosphate buffer를 제조하였다. 0.015 M H2O2가 첨가된 0.01 M phosphate buffer (pH 7.0) 950 μl와 50 μl의 sample을 섞은 후 240 nm에서 1 분 동안의 흡광도 변화를 측정하였다.

3. 통계처리

실험성적은 평균치±표준오차 (Mean±S.E.)로 나타내었으며, 대조군과 실험군과의 평균의 차이는 Student's t-test로 검정하여 p < 0.05 일 때를 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

결 과

1. 벌사상자 추출물 (CF)과 사상자의 추출물 (TF)의 DPPH radical 소거 활성 비교

벌사상자 추출물은 5, 10, 50, 100, 500 μg/ml의 농도에서 각각 31.5, 35.7, 55.3, 70.6, 81.2%의 DPPH radical 소거 활성을 나타내었다. 사상자 추출물은 5, 10, 50, 100, 500 μg/ml의 농도에서 각각 23.7, 28.0, 35.9, 44.4, 63.8%의 DPPH radical 소거 활성을 나타내었다. Dose-response curve로부터 산출된 50%의 DPPH radical 소거 활성을 나타내는 화합물의 농도(IC50)는 ascorbic acid는 1 μg/ml, 벌사상자 추출물은 16 μg/ml, 사상자 추출물은 150 μg/ml이었다(Fig. 1).

Fig. 1.DPPH radical-scavenging activity of ascorbic acid (AC) and water extract of Cnidii Fructus (CF) and Torilis Fructus (TF) : Values indicate the mean±S.E. of four independent experiment. DPPH radical scavenging activity (%) = [(AB-AT)/AB] × 100, AB; absorbance of blank sample, AT; absorbance of tested extract solution.

2. Leydig cell의 cell viability에 대한 영향 비교

벌사상자 추출물 5, 10, 100 μg/ml의 농도에서 Leydig cell의 생존율은 각각 121.0, 132.7, 126.6%로 유의성 있게 증가하였다 (p < 0.001, Fig. 2). 사상자의 추출물은 5, 100 μg/ml의 농도에서 Leydig cell의 생존율이 127.5, 111.8%로 유의성 있게 상승하였다(p < 0.05, Fig. 2).

Fig. 2.Effect of water extract of Cnidii Fructus (CF) and Torilis fructus (TF) on Leydig cells. Leydig cells were treated with CF and TF at 37℃ for 24 h. Each column or point represents the mean±S.E. (n=6). * Significantly different from the normal group (*: p < 0.05, ***: p < 0.001).

3. Hydrogen peroxide-induced cytotoxicity에 대한 항산화효과 비교

Hydrogen peroxide에 의해 유도된 Leydig cell은 정상군 에 비하여 70.8%로 유의하게 cell viability가 감소하였다 (p < 0.05). Hydrogen peroxide에 의해 유도된 Leydig cell에 대하여 벌사상자 추출물은 10, 100 μg/ml의 농도에서 각각 86.3, 84.1%로 항산화 효과를 나타내었다 (p < 0.05, Fig. 3). 사상자 추출물은 10, 50, 100 μg/ml의 농도에서 각각 79.9, 81.4, 83.5%로 H2O2-induced cytotoxicity에 대하여 항산화 효과가 증가되었다(p < 0.001, Fig. 3).

Fig. 3.Protective effect of water extract of Cnidii Fructus (CF) and Torilis fructus (TF) on H2O2-induced cytotoxicity. Leydig cells treated with CF andTF were incubated in the presence or absence of 50 μM H2O2 at 37℃ for 24 h. Each column or point represents the mean±S.E. (n=6). # Significantly different from the normal group (#: p<0.05), * Significantly different from the cells exposed to H2O2 alone (*: p<0.05, ***: p<0.001).

4. Superoxide dismutase (SOD) 활성도에 미치는 영향 비교

정상군의 SOD activity는 9.2 units(of SOD/mg of protein)인데 비하여, 벌사상자 추출물은 1, 5, 10, 50, 100 μg/ml의 농도에서 SOD activity가 각각 9.6, 10.4, 10.6, 10.1, 9.6 units으로 증가하였다. 사상자 추출물은 1, 5, 10, 50, 100 μg/ml의 농도에서 SOD activity가 각각 9.8, 9.0, 9.78, 9.43, 9.61 units으로 비슷한 수준을 유지하였다. 각각의 추출물 모두 통계적 유의성은 나타나지 않았다(fig. 4).

Fig. 4.Effects of water extract of Cnidii Fructus (CF) and Torilis fructus (TF) on SOD activity. Leydig cells treated with CF and TF were incubated at 37℃ for 24 h. Total cell lysate from cultured cells were analyzed for SOD activity formation. Each column or point represents the mean±S.E. (n=3).

5. Catalase 활성도에 대한 영향 비교

Leydig cell에 대하여 정상군의 catalase 활성도는 70.6 units/mg(of protein)인데 비하여, 벌사상자 추출물은 10, 100 μg/ml의 농도에서 catalase 활성도가 각각 98.8, 108.3 units/mg으로 정상군보다 높은 catalase 활성을 보였다 (p < 0.05, Fig. 5). 사상자 추출물은 모든 농도에서 유의성이 나타나지 않았다(Fig. 5).

Fig. 5.Effects of water extract of Cnidii Fructus (CF) and Torilis fructus (TF) on catalase activity. Leydig cells treated with CF and TF were incubated at 37℃ for 24 h. Total cell lysate from cultured cells were analyzed for catalase activity formation. Each column or point represents the mean±S.E. (n=3). * Significantly different from the normal group (*: p < 0.05).

고 찰

溫腎助陽의 효능으로 사용되는 蛇床子를 기원식물의 차이에 따라 벌사상자 C. monnieri (L.) Cusson와 한국에서 사용되는 사상자 T. japonica (Houtt.) Dc.의 추출물에 대하여 남성불임에 미치는 기전을 비교 연구하기 위하여, 생식세포 중 고환의 간질세포인 Leydig cell에 미치는 항산화작용을 비교하였다.

활성산소는 산소가 가지는 화학적 특성으로 인하여 생성되는 산소 프리라디칼 및 이것으로부터 유래된 일군의 산소화합물을 일컫는다. 이 활성산소족 (reactive oxygen species : ROS)의 생성과 제거가 불균형을 나타낼때 oxidative stress가 발생하게 된다. 고환세포내에서 ROS는 대식세포나 중성구 등에 의해 발생할 수 있으며 정자세포에 의해서도 발생할 수 있다. DPPH radical 소거 활성에 대하여 IC50값은 벌사상자 추출물이 16 μg/ml, 사상자 추출물이 150 μg/ml로서 벌사상자 추출물의 DPPH radical 소거능력이 높았다. Leydig cell은 고환의 간질 세포에 해당하는 생식세포주이며, 남성불임 연구에 널리 활용되고 있다. 벌사상자 추출물은 10 μg/ml의 농도에서 Leydig cell의 생존율이 132.8%로 유의성 있게 증가하였고, 사상자 추출물은 5 μg/ml의 농도에서 Leydig cell의 생존율을 127.6%로 유의성 있게 증가하였다. 벌사상자와 사상자 추출물은 각각 Leydig cell에 대해 세포 독성을 나타내지 않았다. 또한 벌사상자 추출물이 사상자 추출물보다 높은 세포 증식효과를 나타내었다.

벌사상자와 사상자 추출물은 각각 hydrogen peroxide에 의해 유도된 Leydig cell에 대하여 항산화 효과를 나타내었으며, 벌사상자 추출물이 15.6%, 사상자추출물은 12.8% 회복시켜 벌사상자 추출물의 항산화 효과가 우수하였다.

SOD는 초산화물을 H2O2와 O2로 전환시키며, 반응성이 큰 superoxide ion을 불균등화시킴으로써 활성산소에 대한 방어역할을 하는 항산화효소이다. Leydig cell에 대하여 벌사상자 추출물은 정상군에 비하여 SOD의 활성도가 증가하였고, 사상자 추출물은 정상군과 비슷한 수준을 유지하였으나 각각의 추출물은 통계적 유의성이 나타나지 않았다.

Catalase는 H2O2 를 H2O와 O2-로 환원시키는 작용을 한다. catalase는 많은 환경적인 돌연변이 유발물질을 비활성화 시키는 중요한 작용을 한다. 또한 염색체 변이를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 벌사상자 추출물은 Leydig cell에 대하여 53.3%의 유의한 catalase 활성도 증가 효과를 나타내었으나, 사상자 추출물은 유의한 효과가 나타나지 않았다.

이상의 결과 벌사상자와 사상자 추출물은 산화 스트레스로부터 남성 생식세포를 보호하였다. 특히 벌사상자는 DPPH radical 소거 능력, Leydig cell의 생존율 증가 효과, hydrogen peroxide에 의해 유도된 Leydig cell에 대한 항산화 효과, catalase 활성도 증가 효과를 통하여 사상자 추출물보다 우수한 항산화 효과를 나타내었다.

결 론

溫腎壯陽의 대표적인 약물인 蛇床子를 벌사상자 C. monnieri (L.) Cusson와 한국에서 사용되는 사상자 T. japonica (Houtt.) Dc.에 대하여 남성생식세포에 미치는 항산화 효과를 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다.

이로써 溫腎助陽 효능으로 男子陽痿의 치료에 활용되어 온 蛇床子의 기원식물로서 벌사상자 C. monnieri (L.) Cusson가 Leydig cell에 대하여 우수한 항산화효과 및 세포보호효과가 있음이 확인되었고 남성불임의 치료에 응용할 수 있는 약물임이 확인되었다.