재료 및 방법

공시 시료

시험물질인 정제봉독은 봉독채집장치를 사용하여 서양종꿀벌로부터 채취한 봉독을 ‘봉독의 간이정제방법’14)으로 멜리틴 함량이 61%인 정제봉독을 구입하여 사용하였다(청진바이오텍(주), 한국). 부형제는 생리식염주사액(대한약품공업(주), 한국)을 사용하였으며, 양성대조물질로는 Ovalbumin(OVA, Albumin Chicken Egg, Sigma-Aldrich, 미국)을 사용하였다. 그 밖에 시약으로는 Freud’s complete adjuvant(FCA, Sigma-Aldrich, 미국)를 시험에 사용하였다.

시험물질 조제

고용량군의 시험물질을 먼저 조제하고, 저용량군의 시험물질은 조제된 고용량군의 시험물질을 동일한 부형제로 희석하여 조제하였으며, OVA 또한 부형제를 이용하여 해당용량으로 조제하였다. Adjuvant와 혼합하는 경우에는 시험물질 또는 OVA를 각각의 부형제를 이용하여 2배 용량으로 조제한 후 동일 용량의 adjuvant와 충분히 에멀젼화 시켰으며 이를 감작 항원액으로 사용하였다. 야기 항원액의 조제는 고용량군의 시험물질을 먼저 조제하고, 저용량군의 시험물질은 조제된 고용량군의 시험물질을 동일한 부형제로 희석하여 조제하였으며, 이를 OVA 또한 부형제를 이용하여 해당용량으로 조제하였다.

시험 동물

시험동물인 특정병원체 부재 수컷 기니픽 32두를 구입하여 사용하였다(샘타코 바이오코리아(주), 한국). 입수시 체중은 278.50~314.21 g이였으며 7일간의 순화 기간을 거쳐 체중 319.14~378.14 g인 30두의 기니픽을 시험에 사용하였다. 본 시험은 AAALAC(Association for Assessment and Accreditaion of Laboratory Animal Care International) 인증을 득한 (주)캠온 실험동물운영위원회 승인을 득하였다(심의번호 14-G269).

사육환경

환경조건 − 온도 23±℃, 상대습도 55±15%, 환기횟수 10~20회/hr, 조명시간 12시간(오전 8시 점등~오후 8시 소등) 및 조도 150~300 Lux로 설정한 (주)캠온 비임상연구소 제1동물사육구역 8호실에서 수행하였다. 시험기간 중 동물실의 온습도는 컴퓨터 시스템을 이용한 자동 온습도 측정기로 매시간 환기횟수 및 조도 등의 환경조건을 정기적으로 측정하였다. 환경측정 결과, 실험기간 동안 온도는 21.7~23.2℃, 상대습도 59.2~69.3%이였으며, 온도, 습도, 환기횟수, 조도 등에서 설정범위를 벗어나 시험의 결과에 나쁜 영향을 끼칠만한 이상은 관찰되지 않았다.

사료, 물 및 오염물질 검사 − 사료는 (주)카길에그리퓨리나(한국)에서 생산하는 기니픽용 고형사료를 구입하여 자유 섭취하도록 하였다. 사료의 성분 분석 성적서를 검토한 결과 시험결과에 영향을 줄만한 요인은 없었다. 물은 지하수를 자외선 살균기 및 미세여과장치로 소독한 후 물병을 이용하여 자유 음수하도록 하였다. 수질검사는 경기도보건환경연구원(경기, 한국)에서 수행하였고 먹는물 수질기준에 적합하였다.

군 분리 − 순화기간 중 건강한 것으로 판정한 동물의 체중을 순위하였고, 각 군의 평균 체중이 균일하게 분포하도록 시험군 구성표과 같이 무작위 분배하였다.

시험군 구성 및 투여량 설정

시험군의 구성과 투여량 및 투여경로는 Table I과 같이 설정하였다. 감작 투여량으로 고용량군의 투여량은 0.05 mg/kg으로 설정하였고, 아래로 공비 2를 두어 저용량군을 설정하였으며, 부형제만을 투여하는 부형제 대조군을 설정하였다. G4는 고용량군의 용량을 adjuvant와 혼합 투여하며, G5는 양성 대조물질을 일반적으로 사용되는 2.5 mg/kg을 adjuvant와 혼합 투여하였다. 또한 G6는 시험물질 본연의 통증 유무를 구분하기 위한 것으로 아무것도 투여하지 않았다. 야기 투여량 설정은 일반적으로 아나필락시스 쇼크를 야기하는 항원량으로 감작시의 고용량을 사용하므로 본 시험에서는 고용량군의 용량을 야기항원량으로 설정하였다. 양성대조물질은 일반적으로 사용되는 양인 2.0 mg/kg으로 하였다.

Table I.Experimental design and treating groups for sensitization and active systemic anaphylaxis test of Guinea pigs

투여경로

기니픽의 감작 − 기니픽의 경배부 피하에 투여하였고, FCA와 혼합하여 투여하는 군은 충분히 에멀젼화 시킨 후에 투여하였다. 감작을 위한 최초 투여일을 Day 1로 설정하였다.

감작기간 − G1, G2 및 G3군은 주 2회, 3주간, 총 6회 감작하였으며, G4와 G5군은 2주에 1회로 4주간 총 3회 감작하였다.

아나필락시스 쇼크반응의 야기 − 최종감작 14일 후에(G1~G3 : Day 33, G4~G5 : Day 43) 야기 항원액을 기니픽의 후지 정맥내에 투여하고 30분간 전신의 아나필락시스 쇼크 증상을 관찰하였다.

관찰 및 검사

일반증상 − 모든 동물을 1일 1회 이상 관찰하여 결과를 개체별로 기록하였다. 1차 감작일을 Day 1로 설정하였다.

체중 −모든 동물에 대하여 첫 투여전, 시험기간 중 제 1 회 및 야기일에 체중을 측정하였다.

아나필락시스 쇼크반응의 판정 − Table II의 판정 기준에 따라 Table III의 쇼크 반응을 판정하였다.

Table II.Indication standard of shock for active systemic anaphylaxis test by Guinea pigs

Table III.Judgment of shock for active systemic anaphylaxis test by Guinea pigs

부검상 − 야기 후 30분간 전신의 증상을 관찰한 후 모든 동물에 대하여 Ether 마취법으로 도살한 후 부검하여 기관점막, 폐, 심장, 흉강 및 횡격막 등에 대한 육안적 관찰을 실시하였다.

결과 및 고찰

일반증상 및 사망 − 투여부위 경결(induration)이 고용량군(G3)은 Day 8부터 Day 33까지, 고용량+adjuvant군(G4) 및 양성대조군(G5)의 모든 동물은 Day 3부터 Day 43까지 관찰되었다(Table IV). 투여부위 가피형성(crust formation)이 고용량+adjuvant군(G4) 및 양성대조군(G5)에서 Day 38부터 Day 43까지 각각 3례와 1례씩 관찰되었으며, 양성대조군(G5)의 1례는 Day 41부터 Day 43까지 관찰되었다(Table IV). 관찰기간 동안 모든 실험에서 사망 개체는 관찰되지 않았다(Table IV). 일반증상에서 관찰된 고용량군(G3), 고용량+adjuvant군(G4) 및 양성대조군(G5) 투여 부위의 경결과 고용량+adjuvant군(G4) 및 양성대조군(G5)에서 관찰된 투여 부위의 가피형성은 정제봉독 및 adjuvant 투여에 의한 것으로 판단하였다.

Table IV.aN is number of animals bI is the induration of clinical signs cC is the crust formation of clinical signs

체중변화 − 시험물질인 정제봉독에 의한 체중변화는 관찰되지 않았다(Fig. 1). 그러나 고용량군+고용량+adjuvant군(G4)의 1례와 양성대조군(G5)의 2례에서 Day 33에 일시적으로 관찰되었다. 하지만 Day 34 이후 회복성을 보였으며, 동일군의 다른 동물에서는 관찰되지 않아 개체차에 의해 나타난 우발적인 변화로 판단되었다.

Fig. 1.Changes of body weights.

아나필락시스 쇼크반응의 판정 − 부형제대조군(G1), 저용량군(G2), 고용량군(G3), 고용량+adjuvant군(G4)에서는 아무런 이상이 관찰되지 않아 아나필락시스 쇼크반응의 판정결과 모두 무증상(asymptomatic)으로 판정하였다(Table V). 양성대조군(G5)에서는 코 문지르거나 핥음(rubbing or licking nose) 1례, 재채기(sneezing) 4례, 과호흡(hyperpnea) 3례, 배변(evacuation) 2례, 호흡곤란(dyspnea) 4례, 보행불안(staggering gait) 5례, 도약(jumping) 3례, 헐떡거리고 몸부림침(gasping and writhing) 5례, 횡와(side position) 5례, Cheyne-Stoke’s 호흡Cheyne-Stoke’s respiration) 3례 등이 산발적으로 관찰되어 아나필락시스 쇼크반응의 판정결과 Severe(2+) 등급의 중등도 아나필락시스 쇼크반응이 나타나는 것으로 판정되었다. 아나필락시스 쇼크반응의 야기시 부형제 대조군, 저용량군, 고용량군, 고용량군+adjuvant군에서는 모두 Asymptomatic(−) 등급이 관찰되었고, 코 문지르거나 핥음, 재채기, 과호흡, 배변, 호흡곤란, 보행불안, 도약, 헐떡거리고 몸부림침, 횡와, Cheyne-Stoke’s 호흡 등이 산발적으로 관찰되어 아나필락시스 쇼크반응의 판정결과 Severe(2+) 등급의 중등도 아나필락시스 쇼크반응이 나타나는 것으로 판정되었다. 조와 권8)의 연구에서는 봉독에서 분리한 멜리틴에 대한 능동성 아나필락시스 쇼크반응을 수행한 결과 양성반응을 보여 항원성이 있는 것으로 보고된 바 있다. 이때 사용한 저용량 멜리틴 투여용량은 0.07 mg/kg 이였다. 그러나 본 연구에서는 화장품이나 가축적용항생제로서 이용되는 꿀벌 독 성분 모두를 갖고 있는 정제봉독에 대한 능동성 아나필락시스 쇼크반응을 알아보고자 하였다. 일반적으로 사용되고 있는 정제봉독 용량의 210배인 0.05 mg/kg을 고용량으로 하여 시험에 사용하였으며, 이들 농도에서의 봉독은 항원성이 없는 것으로 사료되었다.

Table V.ais number of animals bis negative cis positive

부검소견 − 부검소견 관찰 결과, 양성대조군(G5)을 제외한 모든 동물에서는 이상 소견이 관찰되지 않았다(Table VI). 양성대조군(G5)의 모든 동물에서는 폐의 적색반점(diffused red spot)이 관찰되었다. 부검소견에서 관찰된 폐의 적색반점은 아나필락시스 반응과 관련된 소견으로 판단되었다.

Table VI.Necropsy findings

결 론

본 연구는 정제봉독의 항원성 시험의 하나로 Hartley계 수컷 기니픽을 이용하여 부형제대조군(G1), 저용량군(G2, 0.025 mg/kg), 고용량군(G3, 0.05 mg/kg), 고용량+adjuvant군(G4, 0.05 mg/kg) 및 양성대조군(G5, OVA+adjuvant)을 설정하여 부형제대조군 및 양성대조군과 정제봉독 투여군을 비교하였다. 모든 동물군에서 사망동물은 관찰되지 않았고, 일반증상 및 체중변화에서도 정제봉독 투여에 의한 변화는 관찰되지 않았다. 아나필락시스 쇼크반응의 판정 결과, 정제봉독 투여군에서는 쇼크반응이 관찰되지 않았다. 따라서 본 시험 조건하에서 정제봉독의 0.025 및 0.05 mg/kg 용량에서 항원성이 나타나지 않는 것으로 사료된다.