재료 및 방법

실험재료 − 본 실험에 사용한 삼채 뿌리는 2014년에 전북 순창군 농업기술센터에서 김유석 박사가 검증한 후 제공하여 실험에 사용하였으며, 표준품은 우석대학교 약학대학 생약표본실에 보관하고 있다(WSU-14-012).

추출 및 분획 − 삼채 뿌리 1 kg을 조말로 분쇄하여 methanol로 진탕하면서 50℃에서 5시간씩 3회 온침 추출하였다. 그 추출액을 수욕상에서 감압농축하여 methanol엑스 약 84 g을 얻었으며, 이 methanol 엑스를 증류수로 현탁시키고 상법에 따라 동량의 methylene chloride(6.30 g), ethyl acetate(1.24 g) 및 n-butanol(5.86 g)의 순으로 용매 분획하여 각각의 분획을 얻었다.

DPPH Free Radical 소거법에 의한 항산화활성 측정17) − 96well plate에 시료를 ethanol로 각 농도 별로 조제한 용액에 13 μM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)을 일정량씩 가하였다. 10초간 진탕한 후 25℃에서 30분간 방치한 후 microplate reader를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조약물은 L-ascorbic acid를 사용하였다. 항산화 효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다. 각 시료에 대한 DPPH radical 소거작용을 3회 반복하여 측정하였다.

Riboflavin 유래 Superoxide 억제 활성18,19) − 시료의 superoxide 억제능력은 methionine, riboflavin, NBT로 구성된 평가 시스템을 이용하여 광화학 작용을 측정하는 것이다. 반응 혼합액은 2.6 μM riboflavin, 3 mM methionine, 75 μM NBT, 0.1 mM EDTA, PBS(pH 7.4) 및 여러 농도의 시료로 이루어졌다. 혼합물은 light box에 넣은 후 5분마다 자리를 임의로 바꾸어 주면서 15분 동안 방치하였다. Light box 안의 온도는 20±1℃, 빛의 밝기는 5,500 lux를 유지하였다. NBT는 빛 아래에서 blue formazan으로 환원 되며, blue formazan형성 억제능이 superoxide 억제능력인 된다. 이 생성물을 560 nm에서 측정하였다.

Xanthin유래 Superoxide 소거 활성 측정20) − Xanthine/xanthine oxidase에 의해 생성된 superoxide radical은 Thuong 등의 방법에 따라 측정하였다. Nitro blue tetrazolium(NBT, 100 μM), xanthine(250 μM)을 포함하는 phosphate buffer(pH 7.8, 20 mM)와 시료를 함께 혼합한다. 5분 후 xanthine oxidase(0.05 U/mL) 100 μL를 넣고, 37℃에서 30분간 배양시킨 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. Superoxide radical 소거 활성은 시료와 대조군의 NBT의 환원 정도를 비교하여 나타내었다.

Caenorhabditis elegans의 배양21) − C. elegans (N2 : wild type)는 Caenorhabditis Genetic Center(CGC; University of Minnesota, Minneapis, MN)로부터 제공받은 것을 사용하였으며, Escherichia coli OP50를 도말한 Nematode Growth Medium(NGM) agar plate에 20℃에서 배양하였다. 삼채 분획은 DMSO를 용매로 한 stock solution 상태로 멸균된 NGM plates(50℃)에 첨가되었으며, 최종 DMSO농도는 모든 상태에서 0.1%(v/v)를 유지하였다.

수명연장효능평가22) − 수명분석은 20℃에서 독립적으로 3회 실행하였다. 선충의 성장단계를 일치시키기 위해 NGM plate로부터 알만을 분리하여 삼채 분획 수용액(500 μg/mL)을 첨가한 각각의 plate에 옮겨 배양하였고 매일 생존을 확인하였다. 생존여부의 확인은 C. elegans를 platinum wire의 끝으로 자극했을 때의 반응을 통해 확인하였다.

스트레스 저항성 평가23) − 성장 단계가 동일한 선충을 각각의 분획별 plate에서 배양하였다(500 μg/mL). 온도에 의한 내성을 분석하기 위해 선충을 신선한 배지로 옮기고 성체가 된 후 4일째에 36℃에서 배양하여 시간 별로 생존율을 19시간 동안 측정하였다. 산화적 스트레스에 의한 내성은 기존의 방법을 약간 변형하여 평가하였으며, 성체가 된 후 7일째에 일시적으로 선충을 1 mM juglone이 함유된 M9 buffer가 담긴 96 well plate의 well에 옮기고 시간 별로 생존율을 확인하였다(500 μg/mL).

선충 체내의 항산화 효소(SOD, Catalase) 활성 측정24,25) − 성장 단계가 동일한 N2 선충을 각각의 분획별 plate에서 배양하였다(500 μg/mL). 성체가 된 후 4일째에 선충을 모아 M9 buffer로 3회 세척 후 분쇄하여 효소활성 측정에 사용하였다(homogenization buffer: 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5). SOD 활성은 Ibrahim 등의 방법을 응용하여 측정하였다. 먼저 10 mM phosphate buffer(pH 8.0)를 용매로 반응혼합물(1.6 mM xanthine과 0.48 mM NBT) 0.49 mL를 만든 뒤 sample 10 μL와 37℃에서 5분간 pre-incubation시켰다. 그 후 xanthine oxidase 1 mL(0.05 U/mL)을 첨가하고 37℃에서 다시 20분 동안 incubation시킨 다음 69 mM SDS로 반응을 멈추고 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catalase activity는 Aebi의 방법을 응용하여 25 mM H2O2에 시료 50 μL(500 μg/mL)를 3분동안 반응시키고 240 nm에서 흡광도를 측정하였다.

선충 세포 내 활성 산소종(ROS) 분석26) − 세포 내 활성 산소종은 2’,7’-dichlorodihydro fluorescein diacetate(H2DCFDA)를 사용하여 측정하였다. 성장 단계가 동일한 N2 선충을 각 분획별 plate에서 배양하였다(500 μg/mL). 성체가 된 후 4일째 50 μM juglone을 함유한 M9 buffer에 넣고 2시간 노출시킨 뒤 96 well plate에 담긴 50 μL M9 buffer에 5마리씩 옮겼다. 마지막으로 25 μM H2DCF-DA 50 μL를 첨가한 뒤 여기 485 nm, 방출 535 nm에서 흡광도를 각각 측정하였다.

노화 관련인자 분석− 삼채 분획 수용액을 처리한 plate에서 성장 단계가 동일한 N2 선충을 배양하였다. 생식능 측정은 모체와 자손을 구별하기 위해 L4 유충을 개별적으로 매일 깨끗한 plate에 옮겼으며, 자손은 L2 또는 L3 단계에서 계산되었다. 그리고 선충의 식이량을 알아보기 위해 4, 8일이 된 성충을 깨끗한 NGM plate로 옮겨 1분 동안 인두의 움직임을 측정하였다. 또한 선충의 몸길이는 4일째, 운동량은 성체 4일, 8일째에 측정하였다. 몸길이와 운동량은 Olympus software(Olympus, Japan)를 이용해 분석하였고 모든 실험은 동일하게 수회 반복하였다. 모두 각 분획물 500 μg/mL 농도에서 실험을 진행하였다.

통계 분석−통계 자료의 값은 평균값±표준오차(mean±S.E.M.)로 표시 하였다. 그룹 간의 통계적 유의성 검정은 Student's t-test를 통해서 분석하였고 선충의 연속적인 생존도는 Log-rank test분석 방법을 이용하였다. p값은 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001일 때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

결 과

DPPH Radical 소거능−삼채 뿌리 분획 중에서, DPPH radical 소거 효과는 Fig. 1에 나타난 바와 같이 분획들 중 ethyl acetate분획(IC50; 41.2 μg/mL)이 비타민 C(IC50; 10.3 μg/mL)보다는 낮았지만 가장 높은 DPPH free radical 소거효과를 나타내었다.

Fig. 1.DPPH radical scavenging effects of the methanol extract, and its fractions from Allium hookeri.

Riboflavin 유래 Superoxide 소거 활성− Riboflavin 유래 superoxide quenching 활성에서는 대조군 비타민 C가 IC50 값이 31.6 μg/mL로 superoxide quenching 활성을 보였으며, 삼채 뿌리 분획 중 ethyl acetate분획은 IC50값이 199.2 μg/mL로 농도의존적으로 superoxide quenching 활성을 나타냈다(Fig. 2).

Fig. 2.Riboflavin-originated superoxide quenching activities of fractions from A. hookeri.

Xanthin 유래 Superoxide 소거 활성−시료와 대조군의 NBT의 환원정도를 비교하는 xanthine 유래 superoxide quenching 활성에서는 삼채 뿌리의 ethyl acetate분획이 IC50 값이 1.8 μg/mL로 비타민 C(IC50; 0.5 μg/mL)와 비교해 볼 때 비교적 높은 활성을 나타내었다(Fig. 3).

Fig. 3.Xanthine-originated superoxide quenching activities of methanol extract, and its fractions from A. hookeri.

삼채 뿌리 분획의 선충(C. elegans) 수명 연장효능 − 야생형 N2 선충을 이용하여 삼채 뿌리 분획은 Fig. 4에서 보는 바와 같이 분획 중 ethyl acetate분획이 선충의 수명을 가장 크게 증가시켰다. 대조군의 평균 수명 시간은 10.9±0.5 일인 반면, ethyl acetate분획은 선충의 평균 수명을 13.1±0.4 일로 20.1%의 수명연장 효능을 나타냈다(**p<0.01)(Fig. 4, Table I).

Fig. 4.Effects of fractions from A. hookeri on the lifespan of wild-type N2 nematodes. Worms were grown in the NGM agar plate at 20℃ in the absence or presence of fractions from A. hookeri. The number of worms used per each lifespan assay experiment was 37-42 and three independent experiments were repeated (N=3). (A) The mortality of each group was determined by daily counting of surviving and dead animals. (B) The mean lifespan of the N2 worms was calculated from the survival curves. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test. Error bars represent the standard error of mean (S.E.M.). Differences compared to the control were considered signicant at *p<0.05 and **p<0.01 by one-way ANOVA.

Table I.Mean lifespan presented as mean±S.E.M data. Change in mean lifespan compared with control group (%). Statistical significance of the difference between survival curves was determined by log-rank test using the Kaplan-Meier survival analysis. Differnces compared to the control were considered significant at *p<0.05 and **p<0.01.

스트레스 저항성 증가 효능 −삼채 뿌리 분획이 선충의 스트레스 저항성에 미치는 영향은 고온 및 산화적 스트레스 조건에서 선충을 배양하여 생존율을 확인하였다. 선충에게 고온 조건인 36℃에서 생존율을 관찰한 결과 대조군은 2시간 만에 죽기 시작하여 15시간에 모두 사멸한 반면 삼채 뿌리 분획 처리군은 ethyl acetate분획과 n-butanol분획에서 각각 19시간, 17시간으로 생존율이 향상되었다. 대조군의 평균 생존시간이 9.8±0.4시간었으나 ethyl acetate분획 처리군은 11.7±0.8시간(*p<0.05)으로, n-butanol분획 처리군은 11.9±0.6시간(**p<0.01)으로 각각 13.5%와 15.5% 평균 생존 시간을 향상시켰다(Fig. 5A, Table II). 선충에 산화적 스트레스를 유도하기 위해서 1 mM juglone이 함유된 M9 buffer가 담긴 96 well plate에서 배양한 대조군 선충의 최고 생존시간은 12시간이었으나, ethyl acetate분획은 생존시간을 17시간으로 가장 크게 증가시켰다. 평균 생존시간은 대조군의 평균 생존시간이 7.8±0.5시간었으나 ethyl acetate분획 처리군은 평균 생존 시간이 10.4.5±0.8시간으로 32.9%의 생존 시간을 향상시켰다(**p<0.01)(Fig. 5B, Table II).

Fig. 5.Effects of fractions from A. hookeri on the stress tolerance of wild-type N2 nematodes. (A) To assess thermal tolerance, worms were incubated at 36℃ and then their viability was scored. (B) For the oxidative stress assays, worms were transferred to 96-well plate containing 1 mM of juglone liquid culture, and then their viability was scored. Statistical difference between the curves was analyzed by log-rank test. All experiments were done in triplicates.

Table II.Mean lifespan presented as mean±S.E.M data. Change in mean lifespan compared with control group (%). Statistical significance of the difference between survival curves was determined by log-rank test using the Kaplan-Meier survival analysis. Differnces compared to the control were considered significant at *p<0.05 and ** p<0.01.

선충 체내의 항산화 효소(SOD, Catalase) 활성 증가 효능 − xanthine을 기질로 xanthine oxidase의 효소반응 과정 중에 생성되는 superoxide anion을 활용하여 SOD의 활성을 측정하였다. Fig. 6A에서 보는 바와 같이 선충의 ethyl acetate 투여군이 SOD의 활성을 가장 높게 증가시켰으며, 분획들 중 ethyl acetate분획 투여군은 대조군과 비교하여 SOD 활성을 약 15.7% 정도 증가시켰다(**p<0.01). SOD에 의해 생성된 hydrogen peroxide 역시 강력한 반응성을 가진 활성 산소종으로 체내에서는 catalase에 의해 대사되는데, Fig. 6B에서 나타난 바와 같이 분획들 중 ethyl acetate분획 투여군은 대조군에 비해 catalase 활성을 약 5% 정도 증가시켰으나 유의성은 나타나지 않았다.

Fig. 6.Effects of fractions from A. hookeri on the stress resistance proteins of wild type N2 nematodes. (A) The enzymatic reaction of xanthine with xanthine oxidase was used to generate •O2- and the SOD activity was estimated spectrophotometrically through formazan formation by NBT reduction. SOD activity was expressed as a percentage of the scavenged amount per control. (B) Catalase activity was calculated from the concentration of residual H2O2, as determined by a spectrophotometric method. Catalase activity was expressed in U/mg protein. Data are expressed as the mean±S.E.M. of three independent experiments (N=3). Differences compared to the control were considered significant at **p<0.01 by one-way ANOVA.

선충 세포내 활성 산소종(ROS) 감소 효능−삼채 뿌리분획의 세포 내 활성 산소종의 감소 효능을 알아보기 위해 H2DCF-DA와 선충 내부의 활성 산소종을 반응시켜 형광을 관찰하였다. 활성 산소종 형광의 감소 폭은 대조군과 비교하여 ethyl acetate층 투여군에서 약 12.1%(**p<0.01)로 관찰되고, 활성 산소종을 감소시키는 것으로 확인되었다(Fig. 7).

Fig. 7.Effects of fractions from A. hookeri on the intracellular ROS accumulation of wild-type N2 nematodes. The worms were incubated with 50 μM juglone for 2 h, and subsequently treated with the fluorescent probe H2-DCF-DA. Intracellular ROS accumulation was quantified spectrometrically at excitation 485 nm and emission 535 nm. Plates were read 30 min for 90 min. Data are expressed as the mean±S.E.M. of three independent experiments (N=3). Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05 and **p<0.01 by one-way ANOVA.

노화 관련인자의 변화−삼채 뿌리 분획 처리가 선충의 수명 메커니즘에 미치는 영향을 확인하기 위해, 생식, 섭식, 몸길이, 운동량을 측정하였다. 대조군에 비하여 선충의 생식과 4일과 8일째 식이량, 몸길이에 분획 중 ethyl acetate층에 미세한 증가는 있었으나 영향을 미치지 않았다(Fig. 8A-8C). 그러나 4일과 8일째 선충의 움직임을 측정한 결과 4일째는 큰 차이를 보이지 않았으나 8일째에 분획 중 ethyl acetate층의 이동량이 증가하는 것이 확인되었다(Fig. 8D).

Fig. 8.Effects of fractions from A. hookeri on the various aging-related factors of wild-type N2 nematodes. (A) Daily and total reproductive outputs were counted. The progeny was counted at the L2 or L3 stage. (B) On the 4th days of adulthood, the pharyngeal pumping rates were measured. (C) For the growth alteration assay, photographs were taken of worms and the body length of each animal was analyzed. (D) The body movements were counted under a dissecting microscope for 10 seconds. Data are expressed as the mean±S.E.M. of three independent experiments (N=3). Differences compared to the control were considered significant at *p<0.05 by one-way ANOVA.

고 찰

삼채 뿌리 분획 중 ethyl acetate분획은 DPPH radical과 superoxide 소거시험에서 가장 강한 소거활성을 보여 주었다. 이는 삼채는 항염증 효과가 보고되어 있으며,12,13) DPPH radical 소거능과 NO 생성억제효과 있음이 보고된16) 것과 같은 항산화 효능 보고와 부합되는 결과이다. 약 3주 정도의 짧은 수명을 가지고 있어 수명관련 실험에 널리 사용되는 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 모델로 사용하여 삼채 뿌리 분획에 대해 각각의 수명연장에 대한 실험을 하였다.27) 삼채뿌리 분획에 따른 수명비교실험을 위해 일반적인 배양환경에서 야생형 N2 선충을 이용하였으며, 시간에 따른 선충의 생존율을 측정한 결과 ethyl acetate분획이 가장 높은 유의성 있는 생존율을 나타냈다. 선충의 수명 연장 효능은 선충의 생존과 수명에 영향을 주는 스트레스와 관련이 되어 있으므로 생존율과 수명연장에 영향을 미치는 열과 산화적 스트레스 조건에서 선충의 저항성을 측정하였다.28) 열 스트레스 조건에서 삼채 뿌리 분획 중 n-butanol분획과 ethyl acetate분획을 처리한 선충군들이 유사한 효능을 나타냈으며 대조군에 비해 높은 생존율을 보여 주었다. Juglone으로 유발시킨 산화적 스트레스 조건에서는 ethyl acetate분획을 처리한 선충군이 대조군에 비해 가장 높은 생존율을 나타냈다. 항스트레스 능력은 노화방지 및 수명연장과 관련이 있다는 다수의 보고가 있으며,29-31) 삼채 뿌리 추출물이 선충의 스트레스에 대한 저항력을 높여 선충의 수명연장에 영향을 미칠 수 있을 것으로 추측할 수 있다. 보고에 따르면 활성 산소종은 미토콘드리아의 에너지 대사과정, 세포의 손상, phagocytosis 및 주변의 산화물 등에 의해 부산물로 생성하며, 강한 산화적 스트레스를 야기시켜 암을 비롯한 노화 관련된 각종 질환의 원인으로 작용할 수 있고, 항산화제는 이러한 변화를 방어할 수 있을 것으로 보고되어 있다.32,33) 선충 내에서 삼채 뿌리 분획이 항산화 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해 선충의 ROS 축적억제 능력을 측정한 결과 시료를 투여한 군에서 대조군과 비교했을 때 ethyl acetate분획이 가장 높은 ROS 축적을 억제하는 효능을 보여 주었으며, ethyl acetate분획은 선충의 SOD와 catalase의 활성을 가장 크게 증가시켰다. SOD와 catalase의 활성이 노화에 따라 감소하는 것으로 보고되어 있어 선충의 수명연장 효과와도 관련이 있을 것으로 사료된다.34) 삼채 뿌리 분획들은 선충의 구조적, 기능적인 면에 미치는 영향을 실험하기 위해 생식, 인두의 움직임 횟수, 몸길이와 운동량을 측정 하였다. 이와 같은 변화를 대조군과 비교한 결과 운동량을 제외하고는 모두 유의성 있는 변화를 보이지 않았으나 선충의 운동량이 ethyl acetate분획 투여군에서 유의성 있는 증가를 보여 주었다. 이러한 결과는 삼채 뿌리 분획이 생식능력과 몸길이의 변화 및 음식 섭취에는 영향을 미치지 않으나 운동량을 증가시켜 수명연장에 어느 정도 영향이 있을 것으로 판단된다. 마늘, 양파, 부추와 같은 Allium속 식물들은 주성분으로 황화합물을 가지고 있으며, 노화와 관련된 항산화 활성, 항암, 항염증 등의 활성이 보고되어 있으며, 이러한 효능을 나타내는 물질들은 항산화 및 스트레스 저항능력을 향상시켜 선충의 수명연장에 영향을 주는 성분의 구성물질로 작용할 수 있을 것으로 생각되며, 앞으로 삼채 추출물 중에 이와 같은 활성을 나타내는 물질에 대한 더 많은 연구들이 이루어져야 할 것으로 사료된다.10,14)

결 론

삼채 뿌리 분획 중 ethyl acetate분획은 DPPH free radical과 superoxide 소거시험에서 강한 항산화력을 보여 주었으며, 예쁜꼬마선충을 실험 모델로 사용한 수명연장실험에서 삼채 뿌리 분획물 투여군에서도 ethyl acetate분획이 대조군보다 유의성 있게 가장 강한 수명연장 효과를 나타내었다. 스트레스 저항성을 알아보기 위한 열과 산화적 스트레스 저항성 평가와 선충 내에 존재하는 항산화 효소인 SOD와 catalase 활성 평가에서도 삼채 뿌리 분획 중 ethyl acetate분획 처리군에 의해 스트레스 저항성, SOD와 catalse 효소의 활성이 가장 크게 증가되는 것이 관찰되었다. 또한 선충 세포 내의 ROS의 발생량은 삼채 분획 투여군이 대조군에 비해 감소하는 효과를 보여 주었으며, 수명에 미치는 노화 관련 인자의 측정 결과 삼채 뿌리 분획의 처리가 생식능력과 몸길이의 변화 및 음식 섭취에는 영향을 미치지 않으나 운동량을 증가시켜 수명연장에 어느 정도 영향이 있음을 확인하였다.