재료 및 방법

실험재료 – 약용식물은 2011월 10월부터 2014년 8월까지 전국에서 채취되어, 가천대학교 생명과학과 김주환 교수의 감정을 거친 후 실험 재료로 사용되었다(Table I). 사용한 실험 재료의 증거표본은 한국한의학연구원 표본실에 보관 중이다.

Table I.IC50 values were calculated from the dose inhibition curve.

추출 및 시료조제 – 분쇄한 시료 200 g에 2 L의 에탄올을 넣고 실온상태에서 3일간 3회 추출하였다. 이를 여과하여 40의 수욕 상에서 감압농축을 실시한 후, 동결 건조기에서 건조하였다. 추출물은 실험 수행 전에 감압 하에서 P2O5를 이용하여 24시간 이상 재건조한 후 DMSO(Sigma, St. Louis, MO, USA)에 용해시켜 stock solution을 조제하였으며 최종 DMSO의 농도가 0.2%가 되도록 15% TWEEN 80(Sigma, St. Louis, MO, USA)용액으로 희석하여 사용하였다. 추출에 이용한 에탄올 및 그 외 시약은 1급 및 특급 시약을 사용하였다.

In vitro에서 최종당화산물 생성저해 실험 − Vinson과 Howard14)의 방법을 변형하여 실험을 실시하였다. 본 실험에서는 10 mg/ml의 우혈청 알부민(bovine serum albumin, Sigma)을 0.2M phosphate buffer(pH 7.4)에 용해시키고, 0.2 M의 fructose와 glucose를 처리하였다. 이 때 0.2M phosphate buffer에 0.02% sodium azide를 넣어 반응기간 동안 박테리아의 생성을 방지하였다. 이 반응액에 추출물 또는 최종당화산물 생성저해제인 aminoguanidine을 넣은 후 37℃에서 7일 동안 반응시켰다. 이때 시료의 IC50값을 구하기 위해 1, 2.5, 5, 10, 25, 50, 75 μg/ml의 7개 농도에서 실험 하였다. 배양 후에는 spectrofluorometric detector(Bio-TEK, Synergy HT, USA)를 이용하여 형광도를 측정하였다(Ex.: 350, Em.: 450 nm). IC50값은 n=3으로 하여 계산되었다.

결과 및 고찰

최근 당뇨병의 치료방법이 발달되고 청년 당뇨 환자의 증가와 함께 평균 수명이 연장 되고 급성 대사성 합병증으로 인한 사망률이 감소되고 있지만, 당뇨로 인한 합병증이 만성으로 진행되어 발생이 증가함으로 인해 당뇨환자의 합병증 문제가 심각하게 대두되고 있다. 따라서 최근에는 천연물을 이용하여 당뇨 합병증의 요인 중의 하나인 최종당화산물의 생성을 억제하는 약물의 검색을 위해 많은 연구들이 진행되고 있다. 대표적인 최종당화산물의 억제제인 aminoguanidine15,16)은 독성 문제가 제기되어 임상 3상에서 중단되었다. 본 연구팀은 최종당화산물 생성을 강력하게 억제하는 천연물 소재를 발굴하기 위하여 많은 천연소재들의 효능을 검색 발표하였다.17-26)

본 연구에서도 국내에서 자생하는 약용식물 156종의 에탄올 추출물을 이용하여 최종당화산물 생성 저해 효능을 측정하였다. 양성 대조 약물인 aminoguanidine의 IC50값(76.47±4.81 μg/ml)을 근거로 하여, 추출물이 IC50<50 μg/ml이면 효능이 있다고 판단하였다. 15종의 식물 추출물에서 IC50<10 μg/ml로 최종당화산물 생성 저해 효능을 보였고, 그 중에서 4종의 추출물 Alnus firma 의 잎(3.25±0.10 μg/ml), Juncus decipiens 의 전초(4.30±0.44 μg/ml), smilax china의 줄기(3.55±0.21 μg/ml), Vicia amoena의 지상부(4.25±0.06 μg/ml)는 IC50가 5 μg/ml 이하로 aminoguanidine보다 약 8-24배 이상의 우수한 효능이 있음을 알 수 있었다.

자작나무과의 A. firma(사방오리나무)에서 분리된 triterpenoids와 flavonoids가 humanimmunodeficiency virus(HIV-1) 단백질 분해효소에 대해 억제효과를 가지는 것으로 보고되었으며,27) 간성상세포에서 항섬유화 작용을 하여 간질환 치료에 효과가 있다고 보고되었다.28) 또한 A. firma의 잎은 항산화능력이 있다고 알려진 carotenoid, superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT)가 함유되어 있다고 보고되었다.29) 또한 pancreatin과 salivary α-amylase, aldose reductase, yeast α-glucosidase를 억제하여 항당뇨 효과가 있다고 보고되어 당뇨합병증에도 효과가 있을 것으로 예상된다.30) 골풀과의 J. decipiens(등심초)는 이뇨적으로 작용하여, 세뇨관에서 carbonic anhydrase를 억제하여, 개의 신기능에 영향을 끼친다고 보고되었다.31) 백합과의 S. china(청미래덩굴)는 lipoxygenase를 억제하고,32) lipopolysaccharide(LPS) 유도된 macrophage cells에서 cyclooxygenase-2(COX-2)와 같은 염증유발 단백질의 발현을 억제하고 항염과 항통증 작용을 한다고 보고되었다.33) 또한 S. china에서 분리된 steroidal saponin도 cyclooxygenase-2(COX-2)와 종양괴사인자인 tumor necrosis factor(TNF-α)의 생성을 억제한다고 보고되었다.34) 뿌리와 줄기에서 분리된 polyphenol 성분들이 유방암 세포사멸에 효과가 있고,35) 분리된 flavonoid glycoside가 자궁암 세포, 백혈병 세포, 흑색종 세포 등의 암세포에서 apoptosis를 유도한다고 보고되었다.36) S. china 추출물에서 얻은 phenol 성분들이 HIV-1의 활성을 억제하고,37) 고요산혈증 동물에서 고요산혈증과 신장병을 억제한다고 보고되었다.38) 또한 S. china의 잎은 α-glucosidase의 활성과 지방축적을 억제하여 항당뇨와 항비만 효과가 있다고 보고되었다.39) 콩과의 V. amoena(갈퀴나물)은 지상부에 높은 Ca 함량을 나타내고, 지하부에 높은 중금속 함량과 함께 질소의 함량도 높게 유지하면서 오염된 지역에서 생장 적응한다고 보고되었다.40)

위 언급된 4종의 약용 식물은 최종당화산물 생성 억제 효능이 보고된 바 없으며, 양성 대조 약물 보다 8-24배 이상 최종당화산물 생성 억제 효능이 우수한 것으로 확인되었으므로, 전임상 실험을 통해 in vivo효능 확인이 필요하다고 생각된다. 본 연구 결과는 국내 약용식물로부터 안전하고 효능이 좋은 최종당화산물 생성 저해제 후보를 발굴하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있으며, 당뇨에 의해 나타나는 합병증 치료제 개발의 기반을 구축하는데 기여할 수 있을 것이다.

결 론

기원이 확인된 한국산 약용식물 156종의 에탄올 추출물이 in vitro에서 최종당화산물 생성저해 효능이 검색되었다. 그 결과 15종이 양성대조군인 aminoguanidine 보다 우수한 효능이 있음을 확인하였고, 특히 사방오리나무 잎(IC50: 3.25±0.10 μg/ml), 등심초 전초(IC50: 4.30±0.44 μg/ml), 청미래덩굴 줄기(IC50: 8.14±0.20 μg/ml)과 갈퀴나물 지상부(IC50: 4.25±0.06 μg/ml) 4종의 추출물은 양성대조군(aminoguanidine: IC50: 76.47±4.81 μg/ml)보다 8-24배 억제 효능이 우수하므로 당뇨합병증 예방 및 치료제로 개발될 가능성이 있다.