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염증반응은 외상이나 세균의 침입으로 인해 손상된 조직에 대한 생체 조직의 국소적 반응이다. 염증 반응은 병원체의 감염, 화학적 또는 물질적 조직 손상 등으로부터 인체를 보호하기 위해 일어나는 1차적 면역 반응이지만, 염증 반응이 과도해지면 동맥경화증, 류마티스 관절염, 천식, 기관지염, 다발성 경화증등을 유발하는 원인이 됨으로 염증반응을 조절할 수 있는 항염증제의 개발은 다양한 만성 질환을 예방 및 치료하는데 매우 중요시되고 있다(Kaplanski et al., 2003, Namkoong et al., 2015). 염증반응이 일어나면 여러 가지 염증 매개인자들이 만들어지는데 이로 인하여 통증, 발열, 홍반 부종 및 기능 상실 등의 증상이 나타난다(Park et al., 2007). 대식세포와 같은 염증세포들은 nitric oxide (NO), prostagladin E2 (PGE2), tumor necrosis factor-α (TNF-α), 그리고 interleukin-6 (IL-6)등 염증 매개 물질을 분비한다(Lazarov et al., 2000). TNF-α 및 IL-6와 같은 염증매개인자들은 그람 음성균의 세포외막에 존재하는 Lipopolysaccaride (LPS)에 의해 발현되며, LPS는 RAW 264.7 cell과 같은 대식세포 또는 단핵구(monocyte)에서 염증매개인자들의 발현에 관여하는 것으로 알려져 있다(Ko et al., 2014, Willeaume V et al., 1996). 또한 이러한 염증매개물질의 형성은 phospholipase A2의 활성으로 인해 arachidonic acid가 prostagladin으로 바뀌는 과정 및 NO 형성과정으로 이어지게 된다(Kim et al., 2004). 일반적인 NO의 형성은 박테리아를 죽이거나 종양을 제거시키는 중요한 역할을 하지만(Weis et al., 1996) 염증상태에서 iNOS에 의해 생성된 NO는 혈관투과성, 부종등의 염증반응을 촉진하여 염증을 심화시키는 것으로 알려져 있다(Ryu et al., 2003, Mu et al., 2001). COX는 COX-1, COX-2와 같이 두 종류의 이성효소로 존재하며 서로 다른 유전자로부 생성된다. COX-1은 인체 내부의 항상성 유지와 방어 작용에 관여하고 COX-2는 LPS 또는 interleukin-1 (IL-1)의 자극을 통해 발현되며, 발현된 COX-2는 염증매개체인 PGE₂를 생성하여 지속적인 염증반응을 일으킨다(Dubois et al., 1998; Lee et al., 2003; Smith et al., 1996).

연안에 널리 자생하는 해조류는 비타민과 무기질이 다량 함유되어 있으며 식이섬유가 풍부하다. 현재 많은 연구들이 해조류의 항균, 항진균, 그리고 항바이러스 활성을 가진다고 보고되었다(Gonzalez Del val et al., 2001). 누은분홍잎(Acrosorium yendoi Yamada)은 홍조식물문(Rhodophyta), 비단풀목(Ceramiales), 보라잎과(Delesseriaceae)에 속하며, 1930년 Yamada에 의해 처음 발표되었다(Lee, 2008).

본 연구에서는 누은분홍잎 추출물을 대상으로 염증성 질환의 예방 및 치료제 개발의 기초자료로 사용 될 수 있는지 탐색하고, 누은분홍잎이 항염증 활성을 갖는 자원으로서 활용가치의 여부를 확인하기 위해 기능성을 밝히고자 극성에 따라 순차적으로 용매 분획을 활용 분획물을 제작하였다. 이렇게 제작된 시료를 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 처리한 후 염증성 매개인자인 NO와 PGE2의 생성억제 효과 및 이를 합성하는 iNOS와 COX-2 단백질 발현 억제 효능을 확인하였다. 또한, 염증성 cytokine인 TNF-α 및 IL-6의 생성 억제 효과를 조사하였다.

재료 및 방법

재료

제주특별자치도 제주시 구좌읍 행원리 해역에서 2013년 3월 25일에 채집하여 동정된 누은분홍잎(시료관리 및 표본번호: K-192)을 담수를 이용하여 부착생물을 제거한 후, 시료를 음건한 다음 마쇄기로 분쇄하여 미세말화 한 후 4℃에 보관하면서 추출용 시료로 사용하였다.

에탄올 추출물 및 분획물 제작

누은분홍잎 미세말(230 g) 시료를 80% 에탄올을 이용하여 상온에서 24시간 동안 3회 침출하였으며, 그 후 상층액을 회수하고 감압 농축하여 에탄올 추출물(20 g)을 얻었다. 그리고 80% 에탄올 추출물 2 g을 정확히 취하여 증류수 400 ㎖에 현탁시킨 후, n-hexane (400 ㎖ × 3), ethyl acetate (400 ㎖ × 3), buthanol (400 ㎖ × 3)로 순차적으로 분획 및 농축하여 각각의 분획물을 확보한 후 동결 건조하여 n-heaxane, ethyl acetate 및 buthanol 그리고 잔사물를 얻었다. 각 분획물은 해당 용매로 용해시켜 0.2 ㎛ membrane filter (Advantec MFS Inc. USA)로 제균하였고 제작된 추출물 및 분획물은 제주테크노파크 생물종 다양성연구소 –20℃에서 보관하면서 본 연구에 사용하였다.

세포 배양

American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)으로부터 생쥐(murine) 대식세포주인 RAW 264.7을 구입하여, 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (100 units/㎖), 및 streptomycin (100 g/㎖)을 첨가하여 Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM; GIBCO Inc.)에서 보관하였다. 이들 세포들은 37℃에서 95% air, 5% CO2가습 공기 조건 하 포화 상태 (subconfluence)에서 배양하였으며, 3일마다 계대 배양하였다.

Nitric oxide (NO) assay

RAW 264.7 세포를 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 1.5 × 105 cells/㎖로 조절한 후 24 well plate에 접종하고, 실시예의 시료와 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약[1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO2)를 standard로 비교하였다.

세포독성 평가(LDH assay)

RAW 264.7 세포(1.5 × 105 cells/㎖)를 DMEM 배지에 실시예의 시료와 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. LDH (lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 ㎕와 reconstituted substrate mix를 50 ㎕를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 ㎕의 stop solution을 넣은 후 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.

Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5 × 105 cells/㎕로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이후 배지를 제거하고 실시예의 시료와 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 함유한 새로운 배지를 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 PGE2를 측정하기 위해 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 min)하여 상층액을 얻었다. PGE2의 측정은 PGE ELISA kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 r2 값은 0.99 이상이었다.

iNOS및 COX-2 발현 억제 효능 평가(western-blotting)

배양이 끝난 세포를 수집하여 2~3회 phosphate buffered saline (PBS)로 세척 한 후 세포 용해 버퍼 [50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 mM NaF, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenyl methyl sulfonyl fluoride, 25 ㎍/㎖ aprotinin, 25 ㎍/㎖ leupeptin]를 첨가하여 30분간 4℃에서 용해시킨 후 4, 15,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 세포막 성분 등을 제거하였다. 단백질 농도는 bovine serum albumin (BSA)를 표준화하여 Bio-Rad Protein Assay Kit를 사용하여 정량하였다. 분리된 단백질 20~30 ㎍을 8~12% mini gel SDS-PAGE로 변성 분리하여, 이를 PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane (BIO-RAD, Richmond, CA, USA)에 200 ㎃로 2시간 동안 transfer하였다. 그리고 membrane의 blocking은 5% skim milk가 함유된 TTBS (0.1% Tween 20 + TBS) 용액에서 상온에서 2시간 동안 실시하였다. iNOS의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse iNOS (Calbiochem, La Jolla, CA, USA)를 COX-2의 발현 양을 검토하기 위한 항체로는 anti-mouse COX-2 (BD Biosciences Pharmingen, San Jose, CA, USA)를 TTBS 용액에서 1:1000으로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 3회 세정하였다. 2차 항체로는 HRP (horse radish peroxidase)가 결합된 anti-mouse IgG (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK)를 1:5000으로 희석하여 상온에서 30분 간 반응시킨 후, TTBS로 3회 세정하여 ECL 기질(Amersham Biosciences, Piscat-away, NJ, USA)과 1~3분 간 반응 후 X-ray 필름에 감광하였다.

염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6) 생성 억제 효능 평가

RAW 264.7 세포(1.5 × 105 cells/㎖)를 DMEM 배지를 이용하여 세포수를 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2항온기에서 18시간 전 배양 하였다. 이 후 배지를 제거하고 RAW 264.7 세포는 10배 농도로 조제된 추출물 시료 50 ㎕와 450 ㎕의 LPS (1 ㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하였고 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24 시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3 분)하여 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokines 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 −20℃ 이하에 보관하였다. Pro-inflammatory cytokines 정량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.

통계분석

실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 mean ± standard error 값으로 나타내었다. 실험군 사이의 통계적 유의성 검정은 student's t-test 분석방법을 사용하였다(* P < 0.05, ** P < 0.01).

결과 및 고찰

에탄올 추출물 및 분획물의 수율

누은분홍잎 건조시료 230 g을 80% 에탄올로 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 조추출물 20 g을 얻었다. 그리고 여기서 얻어진 에탄올 추출물 2 g을 10배량의 증류수로 현탁 시킨 후에 헥산(n-hexane), 에틸아세테이트(EtOAc) 그리고 부탄올(BuOH) 등을 순차적으로 분획하여 헥산 층에서 504㎎ (25.24%), 에틸아세테이트 층에서 220 ㎎ (11.01%), 부탄올층에서 151 ㎎ (7.56%) 및 잔사인 물 층에서 1,123 ㎎ (56.19%)의 분획물을 얻었다. 에탄올 추출물에 대한 각 순차분획물 중 부탄올 분획물 수율이 7.56%로 가장낮았고, 물 분획물이 56.19%로 가장 높은 수율을 보였다(Scheme 1).

Scheme 1.Systematic purification using solvent partitioning from A. yendoi Yamada.

Nitric oxide 생성억제 효과

RAW 264.7세포는 LPS에 의해 자극되고, 이렇게 자극된 세포는 염증 매개물질인 NO의 생성이 증가하게 되며(Yamamoto et al., 1994), 염증이 수반된 조직 주변에 NO 생성이 급격하게 늘어나면서 초기 염증을 유발하고 악화시키는데 관여한다. LPS로 자극된 RAW 264.7 세포에서 생성되는 Nitric oxide (NO)에 대한 누은분홍잎 추출물의 억제효과를 알아보기 위해서 세포에 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2- 의 형태로 측정하였다. 그 결과 80% 에탄올 추출물, 헥산과 에틸아세테이트 분획물에서 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 높은 NO 생성 억제효과를 관찰할 수 있었다. 특히 에틸아세테이트 분획물인 경우 50 ㎍/㎖의 농도에서도 세포독성 효과도 보이지 않으면서 우수한 NO 생성 억제효과를 보여주었다(Fig. 1-A). 그리고 가장 활성이 높은 에틸아세테이트 분획물의 경우 농도 의존적으로 NO 생성 억제 활성을 보임을 알수 있다(Fig. 1-B).

Fig. 1.Inhibitory effects of 80% EtOH extract and solvent fractions of A. yendoi Yamada on nitric oxide and cell viability production in RAW 264.7 cells. The production of nitric oxide was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 ㎍/㎖) for 24 h in the presence of 80% EtOH extracts and solvent fraction (50 ㎍/㎖) of A. yendoi Yamada. Cytotoxicity was determined using the LDH method. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. *, P < 0.05; **, P < 0.01, A: Inhibitory effects of 80% EtOH extract and solvent fractions of A. yendoi Yamada on nitric oxide and cell viability production in RAW 264.7 cells, B: Inhibitory effects of EtOAc fractions of A. yendoi Yamada on nitric oxide and cell viability production in RAW 264.7 cells, a : 2-amio-4-methyl pyridine (20 uM), b : dexamethason (20 uM) , c : NS-398 (20 uM).

세포 독성에 미치는 영향

LDH는 모든 세포의 세포질 안에 존재하는 효소로서 pyruvic acid 와 lactic acid 간의 가역적 전환에 관여하여 촉매작용을 하며, LDH를 내포한 조직이 파괴될 때 혈액 중으로 흘러나와 혈중 LDH가 상승한다. RAW 264.7 세포(1.5 × 105 cells/㎖)에 시험 약물과 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후, LDH assay 방법을 이용하여 세포 독성을 확인한 결과, 누은분홍잎 모든 추출물 및 분획물에서 세포독성이 나타나지 않았다(Fig.1-A, B).

Prostaglandin E2 생성 억제 효과

급성 및 만성의 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 cytokine인 TNF-α와 IL-6의 발현을 저해시키거나, COX-2 활성 저해를 기인하는 PGE2의 생성 억제를 통해 pro-inflammatory factor의 증가를 수반하는 병변과정을 조절할 수 있을 가능성이 높다(Yoon et al., 2007). RAW 264.7 cell에 누은분홍잎 80% 에탄올 추출물 및 그 분획물(50 ㎍/㎖)과 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 PGE₂ELISA assay kit를 이용하여 PGE₂ 생성 억제 활성을 확인한 결과, 에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 PGE2 생성 억제 활성을 보였다(Fig. 2-A). 또한 에틸아세테이트 분획물에서 농도 의존적으로 PGE2 생성 억제 활성을 보임을 확인할 수 있었다(Fig. 2-B).

Fig. 2.Inhibitory effects of 80% EtOH extract and solvent fractions of A. yendoi Yamada on PGE2 production in RAW 264.7 cells. Cells (1.5 × 105 cells/mL) were stimulated by LPS (1 ㎍/㎖) for 24 h in the presence of 80% EtOH extracts and solvent fraction (50 ㎍/㎖) of A. yendoi Yamada. Supernatants were collected, and the PGE2 concentration in the supernatants was determined by ELISA. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. *, P < 0.05; **, P < 0.01, A: Inhibitory effects of 80% EtOH extract and solvent fractions of A. yendoi Yamada on PGE2 production in RAW 264.7 cells, B: Inhibitory effects of EtOAc fractions of A. yendoi Yamada on PGE2 production in RAW 264.7 cells, a : 2-amio-4-methyl pyridine (20 uM), b : dexamethason (20 uM), c : NS-398 (20 uM).

iNOS 및 COX-2 생성 억제 효과

iNOS는 평소에는 세포 내에 존재하지 않으나 일단 유도되면 장시간 동안 다량의 NO를 생성하며, 생성된 NO는 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다. 그리고 염증상태에서 iNOS와 COX-2에 의해 생성된 NO와 PGE2는 혈관 투과성, 부종 및 통증 등의 초기 염증반응을 촉진시킬 뿐만 아니라 염증매개체의 생합성을 촉진하여 염증을 심화시켜 만성 질환을 유발시키는 것으로 알려져 있다(Tezuka et al., 2001; Kim et al., 2002). 누은분홍잎 80% 에탄올 추출물 및 분획물에 의한 염증 매개인자인 NO, PGE₂생성 억제 활성이 iNOS와 COX-2의 발현 억제로 인한 것 인지 확인하기 위하여 단백질 수준에서의 발현을 Western blot analysis로 확인하였다. RAW 264.7 cell에 LPS (1 ㎍/㎖)와 누은분홍잎 80% 에탄올 추출물 및 그 분획물(50 ㎍/㎖)을 24시간 처리한 후 iNOS, COX-2의 발현 억제 활성을 확인하였다. 그 결과 누은분홍잎의 80% 에탄올 추출물, 헥산 및 에틸아세테이트 분획물에서 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 보이고 있음을 알 수 있으며(Fig.3-A), 에틸아세테이트 분획물의 경우는 뚜렷하게 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성을 보임을 알 수 있다(Fig.3-B).

Fig. 3.Inhibitory effect of 80% EtOH extract and solvent fractions of A. yendoi Yamada on the protein level of iNOS and COX-2 in RAW264.7 cells. RAW 264.7 cells (1.0 × 106 cells/㎖) were pre-incubated for 18 hr, and the cells were stimulated with LPS (1 ㎍/㎖) in the presence of 80% EtOH extracts and solvent fraction of A. yendoi Yamada extract and solvent fractions (50 ㎍/㎖) for 24 hr. iNOS and COX-2 protein levels were determined using immunoblotting method. A: Inhibitory effect of 80% EtOH extract and solvent fractions of A. yendoi Yamada on the protein level of iNOS and COX-2 in RAW 264.7 cells, B: Inhibitory effect of EtOAc fractions of A. yendoi Yamada on the protein level of iNOS and COX-2 in RAW 264.7 cells.

Pro-inflammatory cytokine (TNF-α, IL-6) 생성 억제 효과

TNF-α와 같은 다 기능성 cytokine은 정상조직에서 발현될 뿐만 아니라 병변과정에서 그 발현 정도가 증가되며(Dinarello CA., 2000), 급성 및 만성염증 질환 및 암촉진 과정에서 일어나는 염증반응에 중요한 역할을 한다. 또한 TNF-α가 인간의 염증성 피부질환과 관련이 있음은 아마 많이 보고되어 왔다(Piguet PF et al., 1991, Burrell R, 1994). RAW 264.7 cell에서 누은분홍잎의 전염증성 cytokine인 TNF-α와 IL-6의 발현에 미치는 영향을 ELISA kit를 이용하여 조사하였다. RAW 264.7 cell에 LPS (1 ㎍/㎖)와 누은분홍잎 80% 에탄올 추출물 및 그 분획물(50 ㎍/㎖)을 처리하고 TNF-α와 IL-6의 생성 억제 활성을 확인한 결과, TNF-α인 경우 에틸아세테이트 분획물이 가장 높은 생성억제 활성을 보이고, IL-6인 경우는 헥산 및 에틸아세테이트분획물이 높은 생성 억제 활성을 보였다(Fig. 4-A, 5-A). 또한 농도 의존적으로 에틸아세테이트 분획물에서 TNF-α와 IL-6 생성 억제 활성을 보임을 알 수 있다(Fig. 4-B, 5-B).

Fig. 4.Inhibitory effect of 80% EtOH extract and solvent fractions of A. yendoi Yamada on TNF-α production in RAW 264.7 cells. Cells (1.5 × 105 cells/㎖) were stimulated by LPS (1 ㎍/㎖) for 24 h in the presence of 80% EtOH extracts and solvent fraction of A. yendoi Yamada. Supernatants were collected, and the TNF-α concentration in the supernatants was determined by ELISA. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. *, P < 0.05; **, P < 0.01, A: Inhibitory effect of 80% EtOH extract and solvent fractions of A. yendoi Yamada on TNF-α production in RAW 264.7 cells, B: Inhibitory effect of EtOAc fraction of A. yendoi Yamada on TNF-α production in RAW 264.7 cells, a : 2-amio-4-methyl pyridine (20 uM), b : dexamethason (20 uM) , c : NS-398 (20 uM).

Fig. 5.Inhibitory effect of 80% EtOH extract and solvent fractions of A. yendoi Yamada on IL-6 production in RAW 264.7 cells. Cells (1.5 × 105 cells/㎖) were stimulated by LPS (1 ㎍/㎖) for 24 h in the presence of 80% EtOH extracts and solvent fraction of A. yendoi Yamada. Supernatants were collected, and the IL-6 concentration in the supernatants was determined by ELISA. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments. *, P < 0.05; **, P < 0.01, A: Inhibitory effect of 80% EtOH extract and solvent fractions of A. yendoi Yamada on IL-6 production in RAW 264.7 cells, B: Inhibitory effect of EtOAc fraction of A. yendoi Yamada on IL-6 production in RAW 264.7 cells, a : 2-amio-4-methyl pyridine (20 uM), b : dexamethason (20 uM) , c : NS-398 (20 uM).