Korean Journal of Plant Resources (한국자원식물학회지)

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Triglyceride Control Effect of Agrimonia eupatoria L. in Oleic Acid Induced NAFLD-HepG2 Model

올레산 유도 비알콜성 지방간세포에서 용아초의 중성지방 조절효과

  • Sohn, Eun-Hwa (Department of Herbal Medicine Resource, Kangwon National University) ;
  • Kim, Taeseong (Department of Herbal Medicine Resource, Kangwon National University) ;
  • Jeong, Yong Joon (Department of Life Science, Gachon University) ;
  • Han, Hyo-Sang (Department of Health Administration, Joongbu University, Geumsan 32713, Korea) ;
  • Lea, Youngsung (BIOKOREA CO., LTD.) ;
  • Cho, Young Mi (Department of Life Science, Gachon University) ;
  • Kang, Se Chan (Department of Life Science, Gachon University)
  • Received : 2015.07.13
  • Accepted : 2015.10.21
  • Published : 2015.10.31
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Abstract

Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a kind of liver inflammation caused by an accumulation of fat in the liver. Patients with NAFLD have an increased risk to develop liver fibrosis, which leads to cirrhosis. To investigate hepatoprotective effects of Agrimonia eupatoria L (A. eupatoria), oleic acid-induced NAFLD in HepG2 cells was used and A. eupatoria was fractionated with ethanol (EtOH), n-hexane, dichloromethane (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), n-butanol (BuOH), and H2O. Cells treated with the EtOAc fraction showed the highest lipid accumulation inhibiting effect. A. eupatoria also suppressed triglyceride accumulation and inhibited expression of lipid marker gene, such as a peroxisome proliferator activated receptor γ (PPAR-γ). Moreover, another marker, mRNA expression level of peroxisome proliferator activated receptor α (PPAR-α) was significantly increased by in a dose-dependent manner. These results suggest that A. eupatoria is a potent agent for the treatment of NAFLD.

본 연구는 지방축적이 유도된 HepG2 세포를 이용하여 용아초 EtOAc 분획물의 지방축적억제 효능을 확인하고자 하였다. Oleic acid를 HepG2 세포에 처리하여 지방의 축적을 유도하였으며, 용아초 EtOAc 분획물 25, 50, 100㎍/㎖을 처리하여 실험을 진행하였다. 그 결과 용아초 EtOAc 분획물은 100 ㎍/㎖의 농도에서 HepG2 세포의 지방축적을 효과적으로 억제하였으며, 이 효능의 기전을 확인하기 위하여 지질관련 유전자인 PPAR-α와 PPAR-γ의 발현을 확인하였다. 용아초 EtOAc 분획물은 농도 의존적으로 (25, 50, 100 ㎍/㎖) PPAR-α의 발현을 증가시켰으며, PPAR-γ는 억제함으로써 지질관련 유전자의 발현을 조절하였다. 따라서 용아초 EtOAc 분획물의 지방축적억제 효능은 지방 생성의 주요 인자로 알려진 PPAR-α와 PPAR-γ의 유전자 발현을 통해 작용하는 것으로 보이며, 비교적 저농도인 100 ㎍/㎖에서 효과적으로 지방축적억제 효능을 나타내었으므로 용아초 EtOAc 분획물은 비알콜성 지방간의 위해성을 경감하기 위한 후보물질로서 적합할 것으로 사료되며, 향후 활성성분 규명 및 명확한 작용기전 규명을 통하여 식품, 의약품의 원료에 대한 가능성을 확인할 계획이다.

Keywords

서 언

비알코올성 지방간(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 병리학적으로 알코올성 지방간과 유사하지만, 알코올과 관 련이 없는 간질환으로 중성지방이 간에 과도하게 축적되어 발생하는 질환이다(Ludwig et al., 1980). 만성적으로는 간세포 괴사, 염증 등을 동반하는 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)으로 발전할 수 있으며, 더 나아가 간 섬유화(hepatic fibrosis) 및 간암(liver cancer)에 까지 이르게 할 수 있다(Park et al., 2012). 이러한 비알콜성 지방간의 발병기전에는 인슐린 저항성과 산화적 스트레스 등이 중요한 역할을 하는데(Kim et al., 2006), 최근에는 비알콜성 지방간과 2형 당뇨 및 비만, 심혈관계질환 같은 대사성 질환과의 연관성이 밝혀졌다(Park et al., 2012). PPARs는 전사인자로서 지방대사 및 축적, 지단백대사, 지방세포의 분화, 인슐린 역할 조절에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, PPAR-α는 지방산을 소비하는 베타산화를 촉진시켜 세포 내 지방축적을 억제하고(Hashimoto et al., 2000), PPAR-γ는 지방세포에서 지단백 분해효소, adipocyte fatty acid-binding protein의 전사를 조절한다(Kliewer et al., 1998).

비알코올성 지방간 질환의 치료 약물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나 적합한 치료법은 제시되지 못하고 있으며, 안전한 치료약물을 개발하고자 지방간질환에 대한 한약재 및 천연 자원물의 효능 및 약리 기전을 밝히는 연구가 진행되고 있다(Choi et al., 2009; Sung and Son, 1994; Yoo and Lee, 2010; Yun et al., 2009).

용아초(Agrimonia eupatoria)는 북유럽과 중유럽, 기후가 온화한 아시아와 북미에 분포하는 장미과(Rosaceae)의 여러해 살이풀로 야산이나 들판에 흔히 자라며, 큰등골짚신나물, 선학초, 황화초, 탈력초 등의 이명을 가지고 있다. 용아초는 오래 전부터 복통, 인후염, 두통치료에 사용되어 왔으며(An et al., 2005), 항균(Cwikla et al., 2010), B형 간염 억제(Kwon et al., 2005), 항염증(Ivanova et al., 2013), 인슐린 저항성 개선(Gray and Flatt, 1998), 항산화 효과(Correia et al., 2008)가 보고되어 있다. 지혈제 및 지사제 등의 효능을 가지고 있어 이에 대한 민간요법으로 이용되고 있다. 특히 용아초 성분인 triterpenoid와 페놀화합물은 항암, 항산화 효능 및 간 보호효능이 뛰어나 여러 질환에서 치료제로 많이 이용되어 왔다(Kato et al., 2001; Zhu et al., 2009).

본 연구에서는 용아초의 비알코올성 지방간 완화 기작을 알아내기 위해 oleic acid로 비알코올성 지방간을 유도한 HepG2 세포에 용아초의 다양한 분획물을 처리하여 지방축적억제를 관찰하였으며, 이 실험 결과를 토대로 지방축적억제 효능이 우수한 용아초의 ethyl acetate (EtOAc) 분획물을 이용하여 지방대사 조절자인 PPAR-α, PPAR-γ의 유전자 발현을 관찰하였다.

 

재료 및 방법

실험 재료 및 추출물 제조

용아초는 바이오코리아㈜(Seoul, Korea)에서 제공받아 ITS 염기서열 분석 후 사용하였으며, 30% ethanol (EtOH)을 이용하여 용아초(500 g)를 상온에서 24시간 동안 추출하였다. 추출하고 여액을 감압농축(EYELA, Tokyo, Japan)하여 EtOH 추출물 64 g을 얻었다. 수득한 용아초 추출물에 정제수 1,000 ㎖을 넣고 교반하여 현탁 한 후 계통분획법에 의하여 n-hexane (3.5 g), dichloromethane (CH2Cl2,15.3 g) EtOAc (27.2 g), n-butanol (BuOH, 5.1 g) 및 물(9.7 g) 각각의 용매별 분획물을 획득하였다. 이들 용매별 분획물 중 가장 좋은 활성을 나타낸 EtOAc 분획물을 이용하여 용아초 30% EtOH 추출물과 비교하여 실험을 진행하였다. 용아초 추출물(Voucher No., NMR-G21), EtOAc분획물(Voucher No., NMR-G21-EA), 표본은 가천대학교 생물자원연구실(표본번호: G21)에 보관 중이다.

재료 및 시약

HepG2 세포는 한국세포주은행(Seoul, Korea), Dulbecco’s modified Eagle media (DMEM), fetal bovine serum (FBS), oleic acid (Sigma, MO, USA), trypsin-EDTA 및 penicillin-streptomycin (p/s)은 WelGene사(Daegu, Korea)에서 구입하였다. AdipoRed assay reagent 염색 시약은 Lonza (USA)에서 구입하여 사용하였고, Real-time PCR에 사용된 SYBR Green은 Takara사(Shiga, Japan)에서 구입하여 실험하였다.

Oleic acid 유도 지방간 모델

실험에 사용된 HepG2 세포는 10% FBS, 1% p/s이 첨가된 DMEM 배지를 넣고 37℃, 5%, CO2의 조건으로 배양하였고, 6-well plate에 1 × 105 cell/well의 세포수로 분주하여 20%의 oleic acid가 첨가된 DMEM배지로 3일 동안 지방 축적을 유도하였으며, 1일 간격으로 oleic acid가 첨가된 DMEM 배지로 교체해 주었다. HepG2 세포에 지방축적을 유도하는 동안 용아초 분획물을 25, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 각 배양액에 처리하였고, 3일 후 지방생성 정도를 관찰하였다.

Nile Red Staining

본 시험은 지방세포 내 중성지방 함량을 측정하는 방법을 수정하여 사용하였다 (Wang et al., 2012). 약물을 처리한 세포의 배양액은 버리고 PBS로 2회 세척한 뒤, 4% formaldehyde를 10 ㎕ 씩 각 well에 넣어 실온에서 5시간 동안 고정하였다. Formaldehyde를 제거하고 PBS로 2회 세척한 뒤 50:1의 비율로 AdipoRed assay reagent와 PBS를 제조하여 각각의 well에 100 ㎕ 넣고 상온에서 10분간 염색하였다. 형광 측정은 Multifunctional Micro-plate Reader (TECAN infinite M200, Switzerland)를 이용하여 excitation 485 ㎚, emission 535 ㎚에서 측정하였다.

Real-time PCR

배양한 HepG2 cell을 PBS로 두 번 wash 한 후 RNA Mini Kit (Invitrogen, MD, USA)를 이용하여 total RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 1 ㎍을 사용하여 cDNA를 합성하고, SYBR Green과 PPAR-α, PPAR-γprimer를 이용하여 real-time PCR을 진행하였으며, 대조군 유전자로는 β-actin을 사용하였다(Table 1). PCR 조성은 cDNA를 증류수로 1/100으로 희석하여 8 ㎕를 사용하였고, 10 pmole primer를 각각 0.5 ㎕, ROX plus 12.5 ㎕, 증류수 4 ㎕로 사용하여 total volume을 25 ㎕로 맞추었다. Realtime PCR cycle은 초기변성은 95℃ 10분, 변성은 95℃ 30초, annealing은 60℃ 1분, 신장반응은 95℃ 1분으로 하여 40 cycle을 진행하였고, 융해곡선은 55℃로부터 95℃를 끝으로 하여 0.5℃씩 상승시키며 80번을 반응하여 원하는 형광 값을 검출하였다. 형광신호 정량은 MAX Pro program을 사용하였다.

Table 1.The primer sequences used for real-time PCR

 

결과 및 고찰

용아초의 다양한 분획물의 중성지방 축적 억제 효과

HepG2 세포에 oleic acid를 처리하여 비알코올성 지방간 상태로 유도한 뒤, 용아초 30% EtOH 추출물과 용아초 분획물(Hexane, CH2Cl2, EtOAc, BuOH, H2O)의 지방축적 억제 효과를 측정하기 위해 nile red assay를 시행했다. 실험 결과 용아초 EtOAc 분획물에서 가장 효과적인 억제율을 나타냈으며, 용아초 EtOAc 분획물을 처리한 군에서 용아초 EtOAc 분획물을 처리하지 않은 군과 비교하였을 때 지질축적 억제율이 농도의존적으로 증가하였다. 따라서 oleic acid에 의해 축적된 지질을 가진 HepG2 세포에서 용아초 EtOAc 분획물이 다른 분획물보다 지질축적 억제에 대한 효능이 뛰어났다(Fig. 1).

Fig. 1.Inhibitory effect of A. eupatoria extracts (Hexane, CH2Cl2, EtOAc, BuOH, H2O) on intracellular lipid accumulation in oleic acid-treated HepG2 cells. HepG2 cells treated with 20% oleic acid and/or A. eupatoria extracts (0, 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 ㎍/㎖) for 24 h. Inhibition rate was assessed using the nile red reagent assay.

용아초 EtOAc 분획물의 중성지방 축적 억제 효과

HepG2 세포에 oleic acid와 용아초 EtOAc 분획물 100 ㎍/㎖을 3일 동안 처리하였으며, nile red 시약으로 지방을 염색하고 형광현미경을 이용하여 지방의 축적을 관찰하였다. 실험 결과, HepG2 세포에 oleic acid를 처리한 군에서는 정상대조군에 비해 중성지방이 넓게 축적된 것을 확인하였고, oleic acid와 용아초 EtOAc 분획물 100 ㎍/㎖을 처리한 군에서는 지방의 축적이 효과적으로 억제되었다(Fig. 2).

FIG. 2.Inhibition of lipid accumulation by treatments of A. eupatoria EtOAc layer in HepG2 cells. Cells were stained with nile red O reagent. (A) Normal control (B) HepG2 cells were treated with oleic acid for 72 h. (C) HepG2 cells were treated with oleic acid and EtOAc layer of A. eupatoria (100 ㎍/㎖) for 72 h.

용아초 EtOAc 분획물에 의한 PPAR-α와 PPAR-γ mRNA 발현 조절

용아초 EtOAc 분획물에 의한 비알콜성 지방간 개선효능의 분자생물학적 기전을 알아보기 위해 세포 내 지방산 합성 및 산화에 관련된 유전자의 발현을 측정하였다. 다량의 지방산이 간조직으로 유입될 경우 지방 생성 경로를 통하여 지방산축적이 일어나게 되는데, 축적된 지방산은 미토콘드리아의 마이크로좀과 퍼옥시즘에서 분해되거나 중성지방 형태로 축적된다. 이 과정에서 원활한 기능이 이루어지지 않게 되면 지방간이 유발된다(Smith et al., 2011).

이에 본 연구에서는 용아초 EtOAc 분획물을 25, 50, 100 ㎍/㎖의 농도로 3일간 처리한 후 PPAR-α와 PPAR-γ의 mRNA 발현을 측정하였다. PPAR는 세포 핵에 위치하는 수용체로써(Kim et al., 2005) 지방산과 지방산유도체에 의해 활성화되는 리간드 의존적 전사(ligand-dependent transcription)를 통하여 유전자들의 발현을 조절하는 기능을 한다. 이전 연구들에 의하면 PPAR-α와 PPAR-γ는 당 대사 및 지방대사에 관여하여(Ye et al., 2001) 대사성 질환인 고지혈증과 제 2형 당뇨병 치료에 사용되며, 근육, 지방, 간 조직에 골고루 분포하여 포도당과 지질의 항상성에 관여한다고 알려져 있다. 특히 PPAR-γ는 지방전구세포에서 지방축적에 의한 형태학적 변이와 특이적 단백질 마커들을 발현시켜 adipokine 분비와 관련 유전자의 발현을 증가시키는 대표적 활성인자로 알려져 있다(Rosen et al., 2000; Jeon et al., 2004; Lee et al., 2012; Lee et al., 2012). PPAR-α는 주로 간에 분포하고 있으며 미토콘드리아내의 지방산 산화에 필요한 핵 내 유전자를 발현시키는 것으로 알려져 있다(Lapsys et al., 2000). 실험 결과 oleic acid를 처리한 HepG2 세포에서 PPAR-α의 mRNA는 정상처리군에 비해 발현이 감소되었으며, 용아초 EtOAc 분획물을 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도별로 처리한 군에서 모두 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 3A). 또한 oleic acid를 공급한 HepG2 세포에서 PPAR-γ의 mRNA 발현도는 정상대조군에 비해 증가하였고, 용아초 EtOAc 분획물을 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도별로 처리하였을 때 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3B). 따라서 용아초 EtOAc 분획물은 oleic acid로 유도된 지방 축적에서 PPAR-α가 증가함으로써 지방의 산화를 촉진 시키는 반면, PPAR-γ의 발현은 오히려 감소시켜 지방의 축적을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.

Fig. 3.The effect of A. eupatoria EtOAc extract on mRNA expression levels of PPAR-α (A), and PPAR-γ (B). The relative levels of mRNA expression in HepG2 were measured by real-time PCR. Value were expressed as mean ± SE. #; significantly different from oleic acid (OA)-treated group (0 < 0.05), *; significantly different from normal control (0 < 0.05).

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