서 론

최근 식용이 가능하고 부작용이 적은 천연물을 이용한 건강 기능성 식품과 의약품 개발에 대한 관심이 증가하고 있다. 특히 천연물에 함유된 폴리페놀(polyphenol)계 화합물은 다양한 구조로 이루어져 있으며 항산화 활성을 나타내 암 및 심혈 관계 질환 같은 만성질병에 대한 효과가 높으며, 잎, 줄기, 뿌리, 열매 등에 존재하는 것으로 알려져 있다.

종양을 비롯한 인체 만성질환 대부분을 유발하는 산화적 스트레스의 주요한 원인은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)이다. 적정농도의 ROS는 세포 내 신호전달의 2차 신호전달물질로서 작용하여 세포분열, 노화, 생존, 사멸 등 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 그러나 ROS 수준이 조절되지 않았을 때에는 다양한 종류의 질환과 암을 일으키게 된다[26, 28]. 암 형성에 있어 염증과의 기능적 상관관계는 염증세포에서 생산된 ROS 및 활성질소종(reactive nitrogen species, RNS)과도 밀접한 관계가 있는 것으로 밝혀지고 있다 [3, 4]. 염증은 악성세포의 생존, 증식 및 전이를 촉진시키며, 적응면역반응을 파괴하고 호르몬과 약물에 대한 반응성을 변화시킨다. 이에 따라 최근에는 염증과 면역반응, 종양이 기능적 관계임이 인정되고 있다[7, 23].

암은 우리나라 환자의 사망원인 1위로, 암 중에서도 편평세포암종은 가장 많은 부분을 차지하고 있으며 특히 구강 암에서는 90% 이상을 차지하고 있다[27]. 암은 다단계의 발생과정을 거친다고 알려져 있다. 이와 같은 이유로 암을 치료하거나 극복하는데 여전히 어려움이 있다. 그러므로 진행된 암의 치료보다는 암 발생 전에 미리 예방하는 것이 가장 최선책이다. 천연물에 존재하는 파이토케미컬(phytochemicals)는 기존 항암제에 비해 독성이 적은 안전한 화학물질로서 암을 예방하는 데 중요한 역할을 할 것으로 기대되고 있다[22, 24, 25].

기질 금속단백분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs)류는 조직의 분해 및 재형성과정, 동맹경화, 염증, 류마티스 관절염 그리고 종양의 침윤 및 전이 등과 같은 다양한 질환들에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[1, 8, 12, 19]. 특히 암 침윤(invasion)는 종양세포의 기저막(basement membrane, BM) 의 파괴와 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 분해작용을 통해 진행되며, 이와 같은 작용에 MMP-2 (gelatinase-A, 72 kDa)와 MMP-9 (gelatinase-B, 92 kDa)이 가장 핵심적인 역할을 하는 것으로 이미 널리 알려져 있다[3, 20].

삼백초는 후추목(Piperales), 삼백초과(Saururaceae), 삼백초속(Saururus)에 속하는 여러해살이풀로서 한국, 일본, 동남아시아에 분포하며, 저습지에 군생하는 것으로 알려져 있다[5]. 강력한 항산화 활성을 갖는 플라보노이드(flavonoid) 화합물을 다량 포함하고 있는 것으로 알려져 있다[14]. 삼백초에 관한 연구를 통하여 항산화효과[11], 항염증효과[21], 항천식효과[17] 및 항암효과[16] 등 다양한 약리 활성이 규명되고 있으나, 암 발생 또는 진행억제 약리작용 및 다양한 생리활성에 관한 기전 연구는 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 삼백초의 물 추출물 및 유기용매 분획물의 항산화 효과, 항염증 효과 및 인간구강암세포주에서의 MMP-2와 MMP-9의 발현 및 활성 억제에 의한 암 침윤 억제 효과를 조사하였다.

재료 및 방법

삼백초 물 추출물과 유기용매 분획물 조제

본 실험에서 사용한 삼백초(Saururus chinensis)는 국내산으로 농협으로부터 구입하여 사용하였다. 삼백초 일정량에 20배(wt/vol)의 증류수를 가하고 환류 냉각시키면서 3시간 동안 가열 추출 후 흡입기를 이용하여 감압여과(Whattman, No. 1)하였다. 이 열수추출물을 같은 부피의 헥산(hexane), 클로로포름(CHCl3), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 부탄올(butanol)로 차례로 3번씩 추출 후 각각의 추출물을 농축 시키고, 마지막에 남은 물 층을 동결 건조하여 물 분획물을 얻었다. 실험에 사용한 열수추출물 과 분획별 시료는 Dimethyl sulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 증류수에 1 mg/ml로 준비하여 항산화활성 측정에 사용하였고, 항염증 및 암 침윤억제 측정에는 100 mg/ml 농도로 사용하였다.

전자공여능 측정

Blois [2] 및 Kim 등[15]의 방법에 따라 준비한 삼백초 추출물과 분획물의 0.4 ml를 시험관에 넣고, 1×10-4 M의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) ethanol 용액 5.6 ml을 가하 여 6 ml이 되도록 하였다. 이 혼합액을 4분간 반응시키고 다시 여과한 다음, 총 반응시간이 10분이 되면 525 nm에서 흡광도를 측정하였다(UV-1201, Shimadzu Co., Japan). 전자공여능은 다음 식에 의해 산출하였다.

전자공여능＝{1－(O.D.시료 / O.D.증류수)}×100

세포 및 시약

RAW 264.7 마우스대식세포와 YD-10B 인간구강암세포는 한국세포주은행(Korea Cell Line Bank [KCLB], Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. 세포는 DMEM (Gibco-BRL, Life technologies Inc., Grand Island, New York, USA)배지에 10% FBS (Gibco-BRL), 1% penicillin/streptomycin (Gibco-BRL)을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 계대 배양하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), Griess reagent, Lipopolysaccharides (LPS) 및 Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)는 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

Cell Viability assay

삼백초 추출물에 따른 세포독성을 조사하기 위해 Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 이용하여 측정하였다. 96-well plate에 well (200 μl) 당 RAW 264.7 세포는 2×104개, YD-10B 세포는 5×103개의 수로 접종하여 12시간 동안 배양한 후, 추출물 및 분획물을 적정농도로 처리하였다. 그리고 추가적으로 37℃ 배양기에서 48시간 동안 반응시킨 후, CCK-8 용액을 세포배양액에 10 μl/ well 을 첨가하고 3시간 동안 37℃ 배양기에서 반응하였다. 반응 후, microplate reader (Molecular Devices, Sunnydale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Nitric oxide (NO) assay

생성된 NO의 양을 조사하기 위해 RAW 264.7 세포를 96-well plate에 5×104개/well (200 μl)의 수로 접종하고 12시간 동안 배양하였다. 그 다음 NO 생성을 유도하기 위해 1 ug/ml 농도 Lipopolysaccharide (LPS)를 1시간 전 처리하고, 추가적으로 추출물 및 분획물 농도를 적정농도로 처리하고 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포 배양 상층액과 Griess reagent (Sigma-Aldrich)을 1:1 비율로 반응시켜 실온에서 15분 동안 반응한 후, microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Gelatin Zymography

100 ug/ml 농도의 삼백초 추출물 및 분획물과 0.5 uM 농도의 PMA을 단독 또는 동시에 처리된 혈청 없는 배지에서 YD-10B (5×105) 세포를 24시간 동안 배양한 후, 배지를 모아 Centriprep YM-10 (Millipore, Billerica, MA, USA)을 사용하여 농축하였다. 20 ug농도의 농축된 단백질은 non-reducing sample buffer (0.5 M Tris-Cl pH 6.8, 5% SDS, 20% glycerol, 1% bromphenol blue)와 함께 혼합하여 0.1% gelatin이 포함된 10% sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)에서 전기영동 하였다. 전기영동 후, washing buffer (50 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM CaCl2, 2.5% Triton X-100, 1.0 uM ZnCl2)로 SDS을 제거하고 incubation buffer (50 mM Tris-Cl pH 7.5, 10 mM CaCl2, 150 mM NaCl, 0.02% NaN3)로 37℃에서 18시간 동안 반응하였다. Gel은 Coomassie Brilliant Blue (7% glacial acetic acid, 40% Methanol, 0.25% coomassie blue)로 1시간 동안 염색한 후, destaining solution (7% glacial acetic acid, 40% Methanol)으로 탈색하여 white band을 확인하였다.

Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)

세포로부터 TRIzol 시약(Invitrogen Co., Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 1 ug의 RNA를 가지고 ReverTra ACE PCR RT Master Mix Kit (TOYOBO Co., Osaka, Japan) 을 이용하여 PCR를 수행하였다. 본 실험에서는 MMP-2, MMP-9 및Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) primers (Table 2)을 사용하였고, Housekeeping 유전자인 GAPDH 유전자를 internal control로 사용하였다. 증폭된 PCR 생성물은 ethidium bromide가 포함된 1.5% agarose gel 에 전기영동 하여 UV light상에서 확인하였다.

Table 1.Values represent the Mean ± standard derivation (SD) from triplet repeat replication. ***p<0.001 (ANOVA followed by Duncan′s new multiple-range test).

Table 2.Primers for RT-PCR

Statistical Analysis

3회 반복 실험을 통하여 얻은 결과는 mean ± SD로 나타내었으며, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Student t-test를 실시하여 유의한 결과를 얻었다.

결과 및 고찰

용매별 분획물의 수득율

삼백초 300 g을 이용하여 얻은 열수추출물을 여러 가지 용매로 분획화하고 분획물의 수득율을 확인한 결과, n-hexane 추출물 0.04%, CHCl3 추출물 0.29%, ethyl acetate 추출물 0.78%, n-butanol 추출물 2.25%, H2O 추출물 9.25%로, 물 분획물의 수득율이 가장 높았다.

항산화 효과

ROS 는 정상적으로는 세포의 중요한 신호전달체계를 활성화시켜 항상성을 유지시키는 반면에, 항상성이 조절되지 않을 때에는 비정상적인 기능에 의해 종양을 비롯한 인체 다양한 질환 대부분을 일으키는 주요한 원인이 된다[2, 3]. 따라서 최근에는 ROS를 제거하는 능력인 항산화 능력을 가진 천연 소재에 대한 연구가 활발히 증대되고 있다. 본 연구에서는 삼백초 추출물과 분획물을 가지고DPPH를 환원시키는 능력을 측정하여 항산화효과를 조사하였다. 전자 공여능에 이용되는 DPPH는 화학적으로 안정된 자유라디칼형태로서 본래는 자주색을 띄고 있으며 반응에 의해 자유라디칼이 제거됨에 따라 색이 옅어지는 정도를 측정하는 것으로 지질과산화반응의 억제 정도에 따른 항산화 활성 측정에도 적용되기 때문에 신뢰성이 높은 항산화 능력 측정법이다[2, 15].

측정결과 에틸 아세테이트 분획물이 73.38%의 가장 높은 항산화 효과를 함유하고 있었으며, 그 다음으로는 부탄올 분획물이 69.48%의 높은 항산화 효과을 나타냈다(Table 1). 이와 같은 결과를 바탕으로 본 연구에서는 삼백초의 물 추출에 의한 에틸 아세테이트 분획물과 부탄올 분획물에서 항산화 물질이 다량 함유되어 있음을 확인할 수 있었다. 이는 삼백초 추출 에틸 아세테이트 분획이 가장 높은 항산화 활성을 보인다는 Kang등의 기존 보고[10]를 뒷받침하고 있다.

마우스 대식세포 Raw 264.7에 대한 세포독성 효과

삼백초 추출물 및 분획물의 마우스 대식세포주인 Raw 264.7세포에 대한 세포 독성 효과를 조사하기 위해, LPS 단독 그리고 LPS와 다양한 농도로 함께 처리하여 24시간 동안 반응하였다. 그 결과 대조군과 비교했을 때, 물 추출물, 부탄올 및 물 분획물은 100 ug/ml농도에서55.28%, 74.7% 및 71.47%, 10 ug/ml농도에서는 77.80%, 75.35% 및 71.81%의 생존율을 보였으며 그리고 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트 분획물은 10 ug/ml농도에서 51.22%, 64.86% 및 77.48%, 0.1 ug/ml농도에서는 77.24%, 71.30% 및85.88%의 생존율을 나타냈다(Fig. 1). 이와 같은 결과에서 물 추출물과 헥산 분획물은 고농도에서 50% 정도로 낮은 생존율과 함께 농도 의존적으로 유의하게 세포 성장이 억제됨을 알 수 있었고, 부탄올, 에틸 아세테이트 및 물 분획물은 모든 농도에서 70% 이상의 생존율을 보였다. 따라서 본 연구에서는 세포성장에 영향을 주지 않는 70% 이상의 생존율을 보이는 삼백초 추출물 및 분획물의 농도를 기준으로 항산화 및 항염증 효과를 관찰하였다.

Fig. 1.In vitro cytotoxicity effects of solvent fractions obtained from a Saururus chinensis water extract in RAW 264.7 cells. The cells were treated with solvent fractions obtained from a S. chinensis water extract at different concentrations for 48 hr. Data represent the mean ± S.D. of three independent experiments. (A) WE: Water extract. (B) Hx: Hexane fraction. (C) B: Butanol fraction. (D) CF: Chloroform fraction. (E) DW: H2O fraction. (F) EA: Ethyl acetate fraction. (*; p<0.05 compared with untreated control, **; p<0.01 compared with untreated control).

Nitric Oxide (NO) 생성에 미치는 효과

대식세포(Macrophage cells)는 외부 침입한 세균들의 세포 구성 성분이나 면역세포에서 분비된 cytokines에 의해 활성화되어 tumor necrosis factor-α (TNF-α), nitric oxide (NO), prostaglandin E2 (PGE2) 등과 같은 물질의 분비를 조절한다. NO는 활성산소종의 하나로, 정상적으로는 세포 내에서 세포 신호 전달을 통한 항상성 기능 조절에 관여하나, 체내 염증과정에서는nitric oxide synthase (iNOS)에 의해 과량의 NO가 생성되어 주변조직의 손상을 유도하고, 만성염증을 유발한다고 알려져 있다[6].

본 연구에서는 삼백초 추출물 및 분획물들의 항염증 효과을 조사하기 위해, 마우스 대식세포주인 Raw 264.7세포에 1 ug/ml농도의 LPS를 처리하여 대식세포를 활성화시켜 염증을 유발시킨 후, 다양한 농도의 시료들을 24시간 동안 처리하여 염증 정도의 지표인 NO생성능을 측정하였다. 그 결과, 에틸 아세테이트 분획물에서는 LPS를 함께 처리했을 때, 0.1, 1 및 10 ug/ml의 모든 농도에서 양성대조군인 LPS 단독 처리군에 비해 1.6, 2.0 및 2.2배의 높은 NO 생성 억제를 보였으며, 클로로포름 분획물에서는 0.1 ug/ml 농도에서 1.5배의 NO 생성 억제, 헥산 분획물에서는 0.1 ug/ml 농도에서 1.5배의 NO 생성 억제, 부탄올 분획물에서는 1, 10 및 100 ug/ml 농도에서 2.0, 2.2 및 2.5배의 NO 생성 억제, 물 분획물에서는 1, 10 및 100 ug/ml 농도에서 1.5, 2.2 및 2.0배의 NO 생성 억제, 그리고 물 추출물에서는 1, 10 ug/ml 농도에서 2.1, 2.1배의 NO 생성이 억제됨을 확인하였다. 이와 같은 결과들을 바탕으로 LPS 단독 처리군은 대조군에 비해 NO생성은 5배 정도 현저히 증가하였고, 각각의 추출물 및 분획물은 세포 성장에 영향을 주지 않는 농도에서LPS 단독 처리군에 비해 유의하게 낮은 NO 생성능을 보였다(Fig. 2).

Fig. 2.Inhibitory effects of solvent fractions obtained from a Saururus chinensis a water extract on LPS-induced NO production in RAW 264.7 cells. The cells were incubated for 24 hr with LPS in presence or absence of indicated concentrations of solvent fractions obtained from a S. chinensis water extract. Data represent the mean ± S.D. of three independent experiments. (A) WE: Water extract. (B) He: Hexane fraction. (C) B: Butanol fraction. (D) CF: Chloroform fraction. (E) DW: H2O fraction. (F) EA: Ethyl acetate fraction. (*; p<0.05 versus only LPS-treated group, **; p<0.01 versus only LPS-treated group).

인간구강암세포(YD-10B)에서의 세포독성 효과

Oral Squamous cell carcinoma (구강편평세포암종, OSCC) 은 암의 가장 흔한 형태로서 90% 이상을 차지하고 있다[27]. 또한 다른 암과는 다르게 구강암은 조기 발견과 치료 및 예방 효과를 육안적으로 관찰하기에 용이하여 암 예방을 위한 가장 좋은 모델로 인정받고 있다. 본 연구에서 사용된 YD-10B 세포는 Yook et al. [25]에 의해 처음 확립되었고, Kim et al. [13] 및 Hwang et al. [9]들에 의하여 종양형성, 암 침윤 및 암 전이와 연관성이 있음을 이미 보고되었다.

YD-10B 세포에서 삼백초 추출물 및 분획물들의 세포독성 효과를 조사하기 위해, 시료들을 다양한 농도로 함께 처리하여 48시간동안 반응하였다. 그 결과 대조군과 비교했을 때, 100 ug/ml 농도 처리에서 물 추출물, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물 분획물은 82.82%, 70.67%, 82.13% 및 85.43%로 모두 70% 이상의 생존율을 보였으며, 헥산과 클로로포름 분획물은 61.80%와 68.89%로 낮은 생존율을 나타냈다(Fig. 3). 이와 같은 결과를 바탕으로 물 추출물, 에틸 아세테이트, 부탄올 및 물 분획물은 YD-10B 세포의 생존율에 영향을 미치지 않음을 알 수 있었고, 헥산과 클로로포름 분획물은 YD-10B 세포의 증식 억제 효과를 보임을 알 수 있었다. 그러므로 삼백초 추출물 및 분획물들 중에서 물 추출물, 에팉아세트, 부탄올 및 물 분획물들이 YD-10B 구강암세포를 이용한 암 침윤성과 연관된 MMP-2와 MMP-9에 미치는 효능 연구를 위한 유효한 물질임을 알 수 있었다.

Fig. 3.In vitro Cytotoxicity effects of solvent fractions obtained from a Saururus chinensis water extract in YD-10B cells. YD-10B cells were treated with solvent fractions obtained from a S. chinensis water extract at different concentrations for 48 hr. Data represent the mean ± S.D. of three independent experiments. (A) WE: Water extract. (B) Hx: Hexane fraction. (C) B: Butanol fraction. (D) CF: Chloroform fraction. (E) DW: H2O fraction. (F) EA: Ethyl acetate fraction. (*; p<0.05 compared with untreated control, **; p<0.01 compared with untreated control).

인간구강암세포(YD-10B)에서의 MMP-2와 MMP-9의 발현 및 활성 억제 효과

본 연구에서는 삼백초 추출물 및 분획물들의 YD-10B 인간 구강암세포에서 PMA에 의한 암 침윤 및 MMP-2와 MMP-9 활성 증가에 미치는 효과를 조사하였다. 이를 위하여 100 ug/ml 농도의 삼백초 추출물 및 분획물과 0.5 uM 농도의 PMA을 단독 또는 동시에 처리하여 YD-10B 세포를 혈청 없는 배지에서 배양하였다. 그리고 24 시간 동안 배양한 후, 배지의 상층액은 gelatin zymography법을 통해 MMP-2 및 MMP-9 단백질의 활성을 관찰하였고, 배양된 세포에서는 RT-PCR법을이용하여 MMP-2 및 MMP-9 mRNA 발현을 분석하였다. 그 결과는 Fig. 3. 그리고 Fig. 4에서 나타난 것처럼, PMA를 단독 처리한 세포에서는 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 MMP-2 및 MMP-9의 단백질 활성 및 mRNA 발현이 모두 뚜렷하게 증가하였으며, 이는 기존의 PMA에 의한 암세포에서의 MMP-2/-9에 대한 연구와 유사한 결과이다[4, 9]. 본 연구 결과에서는 PMA와 삼백초 추출물 및 분획물을 동시 처리한 세포에서 에틸 아세테이트 분획물이 PMA에 의해 유도된 MMP-2 및 MMP-9의 단백질 활성 및 mRNA 발현 모두에서 가장 뚜렷하게 억제하였고, 그 다음으로는 물 추출물이 유의하게 억제함을 알 수 있었다.

Fig. 4.Effect of solvent fractions obtained from a Saururus chinensis on mRNA expression of MMP-2/9 in PMA-treated YD-10B cells. YD-10B cells were treated with the indicated concentration (100 ug/ml) of solvent fractions obtained from a S. chinensis water extract 2 hr prior to PMA (0.5 uM) stimulation. (A) 24 hr later, the levels of MMP-2/9 mRNA were determined by RT-PCR. GAPDH were used as the internal control. (B, C) The relative expressions of MMP-2/9 mRNA were analyzed the band intensity using a GelQuant.NET program. WE: Water extract, Hx: Hexane fraction, CF: Chloroform fraction, EA: Ethyl acetate fraction, B: Butanol fraction, DW: H2O fraction.

Fig. 5.Effect of solvent fractions obtained from a S. chinensis on the activities of MMP-2/9 in PMA-treated YD-10B cells. YD-10B cells were treated with the indicated concentration (100 ug/ml) of solvent fractions obtained from a S. chinensis water extract 2 hr prior to PMA (0.5 uM) stimulation. 24 hr later, the activities of MMP-2/9 protein in the conditioned media were determined by gelatin zymography. WE: Water extract, Hx: Hexane fraction, CF: Chloroform fraction, EA: Ethyl acetate fraction, B: Butanol fraction, DW: H2O fraction.

결 론

삼백초의 물 추출물과 유기용매 분획물의 항산화 효과, 항염증 효과 및 인간구강암세포, YD-10B 세포에서의 MMP-2와 MMP-9의 발현 및 활성 억제에 의한 암 침윤 억제 효과를 확인하였다. 본 연구를 통하여 삼백초 추출 에틸 아세테이트 분획물은 가장 우수한 항산화 및 항염증 작용을 보였으며 또한 YD-10B 구강암세포에서 MMP-2 및 MMP-9의 발현과 활성을 억제함으로써 암 침윤을 억제하는 것으로 나타났다. 이와 같은 본 연구 결과는 구강 암의 예방 및 치료를 위한 항암제로서의 가능성을 암시하고 있다. 하지만 향후 다양한 암세포주와 in vivo에서의 항암작용과 이들에 대한 기전 연구가 추가적으로 더 필요할 것으로 사료된다.