Ⅰ. 서 론

류마티스관절염(rheumatoid arthritis)은 전신성 자가 면역질환으로, 만성적인 염증과 다발성 관절의 파괴를 특징으로 하는 질환이다1,2). 최근에 와서 치료비용과 사회경제적인 비용이 계속해서 증가하고 있는 추세를 띠고 있으므로1,2,3), 류머티스 관절염에 대하여 관심이 많이 증대되고 있다. 근래에 와서, 류머티스 관절염에 대한 병태생리에 대한 이해의 증가로 인하여 치료에 많은 진보가 있었으나, 약물의 부작용, 높은 약제비용 등의 어려움이 존재하고, 완화와 악화를 반복하면서 그 증상이 오랫동안 지속되는 등의 문제점이 있으므로3,4), 다양한 치료법이 시도되고 있으며, 한약이나 한약재를 이용한 한의치료도 비교적 좋은 치료법으로 우리나라 국민들 속에서 인정받고 있다.

Collagen으로 유발시킨 관절염은 류머티스 관절염과 육안적, 조직학적이나 면역 담당 세포의 활성화 측면에서 비슷하게 관찰되므로5,6,7), 류머티스 관절염(CIA；collagen-induced arthritis)의 실험모델로 많이 사용되고 있다8).

仙茅는 수선화과(Amarylidaceae)에 속하는 다년생 초본인 仙茅 Curculigo orchioides Gaertn.의 뿌리줄기를 기원으로 하고 있는 한약재이며9,10), 補腎陽, 溫脾陽, 强筋骨, 祛寒濕하는 효능을 지니고 있는 한약재로9,10), 한의학 임상에서 많이 활용되고 있다.

한의학에서는 關節炎을 歷節風, 鶴膝風, 白虎風, 白虎歷節風, 痛風, 痛痺, 痺痛, 痹證, 痺症, 風痺, 痛痺 등의 범주에 속한다고 보고 있으며11), 관절염의 치료방법으로는 實證인 경우에는 주로 祛風, 散寒, 除濕, 溫通經脈, 淸熱, 化痰祛痰, 活血通絡 등의 방법을 활용하고 있으며, 虛證의 경우에는 調補氣血, 補腎助陽, 滋陰養肝, 補肝腎 등의 방법을 활용하고 있다 11,12,13). 이에 저자는 祛寒濕, 强筋骨하는 효능을 지니고 있는 仙茅가 관절염에 효과가 있을 것으로 파악하였고, 관절염에 미치는 영향을 실험적으로 규명하기 위하여, in vivo와 in vitro 실험을 통하여 분석하고자 하였으며, DBA/1OlaHsd 생쥐에 collagen Ⅱ(CⅡ)로 관절염을 유발시킨 후에 仙茅의 熱水 추출물을 투여한 결과, 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하고자 한다.

Ⅱ. 재료 및 방법

1. 시료 제조방법

본 실험에 사용한 仙茅(Curculigo orichiodes Gaertn；Curculiginis Rhizoma)는 옴니허브 (영천, 경북, 한국) 제약회사에서 500 g을 구매하여, 약전 규격에 부합되는 것만을 대구한의대학교 한의과대학 본초학교실에서 정선하여 시료로 사용하였다.

2. 시약 및 기기

Bovine typeⅡ collagen, acetic acid, complete freund's adjuvant, methotrexate(MTX), 생리식염수, heparin, ACK 용액, NH4Cl, KHCO3, demineralized water, trypan blue, ethyl ether, collagenase, TMB, antibody biotin-conjugated, formaldehyde, diethyl pyrocarbonate(DEPC), trypsin-0.2% EDTA, 3-4, 5-dimethylthiazol-2, 5-carboxyme thoxyphenyl-2,4-sulfophenyl-2H-tetrazolim(MTS), 2,7-dichloro-dihydrofluorescindiacettate(DCFH-DA), chloroform, RPMI-1640 배양액, trichloroacetic acid, isopropanol, Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS) 등은 Sigma(USA) 제품을, IL-1, IL-6와 TNF-α는 ELISA kit(Biosourse., USA), antibody Avidin-HRP conjugeted(R&D system, USA), 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)은 Hyclone 사(Logan, USA) 제품을, DMED은 Gibco社(Gaithersburg, MD, USA) 제품을, RNase는 Pharmingen社(Torreyana, USA) 제품을 구입하여 사용하였으며, 멀티플렉스 ELISA bid 분석 키트는 Milipore사 제품을, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.

본 연구에 사용된 기기는 열탕추출기(대웅, Korea), microwave oven(LG, Korea), spectrophotometer(Shimazue. Japan), centrifuge(Centrikon, Sigma), Deep-freezer(Sanyo, Japan), primus 96 thermocycler system(MWG Biotech., Germany), turbo thermal-cycler TM(Bioneer Co., Korea), ice-maker (Vision, Korea), CO2 incubator(Forma scientific Co., USA), clean bench(Vision scientific Co., KMC-14001, Korea), vaccum pump, rotary vaccum evaporator(Büchi 461, Switzerland), freeze dryer(EYELA FDU-540, Japan), autoclave(Hirayama, Japan), imager system(Kodak, USA), plate shaker(Lab-Line, USA), ELISA reader (Molecular devices, USA), cell strainer(FALCON, USA), 96-well Costar 접시(Corning Inc, Cambridge, Mass. USA) 및 homogenizer(OMNI, USA) 등을 사용하였다.

3. 실험 재료 및 추출방법

仙茅의 열수 추출은 분쇄기로 분쇄한 다음 시료 100 g에 증류수 1 L를 넣고, 100℃에서 3시간 열수 추출하였다. Kimble-filtering flask에 funnel을 장착하고 여과지(Whatman No.2)를 사용하여 추출물을 여과한 뒤 여과액을 미리 항량된 수기에 넣어 45~50℃의 수온에서 rotary vacuum evaporator(JP/N-1000X, EYELA)를 사용하여 감압농축 후 동결건조 (FD5508, IlShin)하였다. 추출물(Extract of curculiginis rhizoma；ECR)은 초저온냉동고에 보관하면서 세포실험과 동물실험에 필요할 때마다 적당량을 증류수에 희석하여 사용하였다.

4. 세포배양

마우스 대식 세포주인 Raw264.7 cell은 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Raw264.7 cell은 10% Fetal Bovine Serum (FBS)를 첨가한 DMEM을 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였다.

5. 세포독성 및 NO 생성량 분석

시료의 세포독성을 측정하기 위해 Cell counting Kit-8을 이용하였다. 96 well plate에 1×105 cells/well 분주한 후 Seeding 한 후 증숙 시료를 정해진 농도로 ECR을 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 25 ㎍/㎖, 12.5 ㎍/㎖, 6 ㎍/㎖, 3㎍/㎖ 농도로 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하여 CCK-8 용액을 처리하고 37℃ Incubator에서 30분 동안 반응시켰다. CCK-8 측정은 ELISA(Multiscan spectrum, Thermo Scientific)를 이용하여 분석하였다.

NO 측정은 Raw264.7 cell을 96 well plate에 1×105 cells/well 분주한 후 5% CO2, 37℃에서 배양하여 사용하였다. 분주한 세포에 LPS 1 ㎍/㎖ 처리한 후 정해진 농도의 ECR을 처리한 후 24시간동안 배양한 후 배지에서 분비된 Nitric oxide를 Griss reaction에 기초한 NO coloricmetric assay(R&D System Inc., Minneapolis, MN, USA)로 분석하였다. 세포가 생산한 NO는 Sodium Nitrate를 사용하여 표준곡선을 작성한 후 NO 함량을 정량하였다.

6. 싸이토카인 및 Prostaglandin E2(PGE2) 측정

Raw264.7 cell을 12 well plate에 에 5×105 cells/well분주한 후 5% CO2, 37℃에서 배양하여 사용하였다. 분주한 세포에 LPS 1 ㎍/㎖ 처리 한 후 정해진 농도의 증숙 시료를 처리한 후 24 시간동안 배양한 후 배지에서 분비된 PGE2(R&D System Inc., Minneapolis, MN, USA)를 PGE2 kit를 이용하여 측정하였다. PGE2 함량은 다기능 마이크포플레이트 리더기에서 540 nm에서 측정하였다. 대식세포가 생산한 싸이토카인(TNF-alpha, IL-1beta, IL-6, IL-12)은 Multianalyte ELISA Array kit(Milipore)를 사용하여 luminex luminometer(Awareness Technology Inc., Pal City, FL, USA) 리더기에서 490 nm에서 측정하였다.

7. RT-PCR

Raw264.7 cell을 12 well plate에 에 5×105 cells/well분주한 후 5% CO2, 37℃에서 배양하여 사용하였다. 분주한 세포에 LPS 1 ㎍/㎖ 처리 한 후 정해진 농도의 증숙 시료를 처리한 후 24 시간동안 배양한 후 세포를 수집하였다. 수집된 세포는 RNAzolB를 이용하여 synovial 세포막을 터트린 후 RNA를 추출하는 방법을 택하였다. 추출한 RNA는 diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 처리한 20 ㎕의 증류수에 녹여 RT-PCR에 사용하였다.

역전사(reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3 ㎍을 75℃에서 5분 동안 변성(denaturation)시키고, 이에 2.5 ㎕ 10mM dNTPs mix, 1 ㎕ random sequence hexanucleotides(25 pmole/25㎕), RNA inhibitor로서 1 ㎕ RNase inhibitor(20 U/㎕), 1 ㎕ 100 mM DTT, 4.5 ㎕ 5×RT buffer(250 mM Tris-HCl, pH8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 가한 후, 1 ㎕의 M-MLV RT(200 U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다. 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심침강하여 37℃ 항온 수조에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction(PCR)에 사용하였다.

PCR은 항온수조 방식의 Turbo Thermalcycler TM(Bioneer Co., Korea)를 이용하여 수행하였다. 반응은 이미 합성된 3 ㎕의 cDNA를 주형으로 사용하고, 주형에 대한 primer는 β-actin, interleukin-6(IL-6), interleukin-12(p35, IL-12), interleukin-12(p40, IL-12), 그리고 interferon-γ(IFN-γ) 를 증폭하기 위하여 sense primer(20 pmole/㎕)와 antisense primer(20 pmole/㎕)를 혼합하여 1 ㎕를 가하고, 다시 3 ㎕ 2.5 mM dNTPs, 3 ㎕ 10×PCR buffer(100 mM Tris-HCl, pH8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl2), 그리고 0.18 ㎕ Taq polymerase(5 U/㎕)를 첨가한 다음 최종 부피가 30 ㎕ 되도록 멸균증류수를 가하고 predenaturation；95℃, 5분, denaturation ；95℃, 1분, annealing；55℃, 1분, elongation；72℃, 1분씩 25 cycles한 뒤 postelongation을 72℃에서 3분 동안의 조건으로 PCR을 수행하였다. 각 PCR products는 20 ㎕씩 1.2% agarose gel에 loading하여 120V 조건에서 20분간 전기영동을 통하여 분석하였다.

Oligonucleotide의 염기배열은 다음과 같다；

PCR product의 양은 Windows 1D main program (AAB, USA)을 이용하여 최고값(height, Ht)으로 측정하였다.

8. Western Blot analysis

RAW264.7 대식세포를 2×105 cells/mL의 농도로 6-well plate에 분주하여 12시간 배양한 후에 ECR을 농도별(100, 200 ㎍/㎖)로 처리한 다음, LPS 1 ㎍/㎖를 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 phosphate buffered saline(PBS)으로 세척한 후 세포를 얻어 원심분리하여 pellet에 lysis buffer를 가하여 얼음에 incubation 후 13,000 rpm으로 15분 동안 원심분리 하여 상등액을 모았다. 모은 상등액은 bovine serum albumin(BSA)을 사용하여 단백질을 정량하였다. 단백질 20 μL을 5×sample buffer에 넣고 100℃에서 5분간 불활성화 시킨 후 12% SDS polyacrylamide gel에 전기영동 하였다. 분리된 단백질은 PVDF membrane으로 transblotting 한 후 5% non-fat dry milk에서 90분 동안 blocking 하였다. JNK, ERK, iNOS, COX-2, IL-1β, TNF-α 와 GAPDH 항체(Promega사)는 각각 1：1,000, 1：2,000의 비율로 4℃에서 overnight 시킨 후 tris-buffered saline Tween-20(TBST) buffer로 10분간 3회 washing하였고 2차 항체는 1：1,000의 비율로 희석하여 2시간 상온에서 부착시켰다. TBST buffer로 10분간 3회 washing한 membrane에 ECL(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)을 처리하여 LAS-3000(Fujifilm, Tokyo, Japan)으로 측정하였다.

9. 동물 분리 및 관절염 유발

실험 동물은 FOLAS INTERNATIONAL(서울, Korea)에서 분양받은 6주령의 DBA/1OlaHsd mice를 2주일 동안 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 22±2℃, 1일중 12시간은 200~300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 사료는 고형사료(조단백질 22.1 % 이상, 조지방 8.0 % 이하, 조섬유 5.0 % 이하, 조회분 8.0 % 이하, 칼슘 0.6 % 이상, 인 0.4 % 이상, 삼양사, 항생제 무첨가)와 물을 충분히 공급하였다.

관절염 유발은 collagen Ⅱ(CII) 와 complete adjuvant를 DBA/1J 생쥐의 꼬리 피하주사를 통하여 시행 하였고, 10마리씩을 한 군으로 하여 정상군, 대조군(C), ECR 투여 200 ㎎/㎏와 100 ㎎/㎏ 4개 군으로 나누었다. ECR은 각각 농도별로 CII 1차 접종 후 5주(35일)간 1일 1회씩 경구 투여하였다.

10. 관절염 지수 분석

2차 CII 접종 후 DBA/1J 생쥐의 각 4개의 발(paw)에서 관절염 징후를 0 = no arthritis, 1 = small degree of arthritis, 2 = light swelling, 3 = medium swelling, 4 = severe swelling, 5 = severe swelling and non-weight-bearing 등으로 구분한 뒤, 각 4개의 발에 각 등급에 따라 0~5점까지 점수를 부여 하고, CIA 유발 정도를 1주일 간격으로 기록하였다.

11. 관절세포수 분석

관절은 잘게 가위로 chopping한 후 collagenase 1 ㎎/㎖(in 2% FBS + RPMI 1640)을 넣고 37℃ shaker(180 rpm, 20 min.) 배양기에서 배양한 후 상층액을 회수하는 방법으로 4회 반복하였다. 이것을 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 백분율(%)로 분석한 후 총세포수를 적용하여 각 조직에서의 절대세포수(absolute number)를 산출하였다.

12. 혈청 내 싸이토카인 분석

4주간 index 값을 측정 후, ethyl ether로 마취하여 심장천자법으로 혈액을 채혈한 후 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청에서 TNF-α, IL-1beta, IL-6 농도 측정은 CIA 실험 종료 후에 enzyme-linked immuno-sorbent assay(ELISA, biosource, USA)로 생성량을 측정하였다. 각 well에 CIA 생쥐의 혈청 100 ㎕(1/100 dilution)씩 분주하고, 1시간 동안 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충 용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugeted 100 ㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 50 ㎕의 stop 용액을 처리하고, ELISA reader 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

13. 통계처리

모든 실험값은 평균 ± 표준오차(mean ± SD)로 표시하였으며, 유의성 검증은 Student's T-test 분석방법을 이용하여 결정하였다.

Ⅲ. 결 과

1. 선모열수 추출물의 세포독성에 대한 영향

대식세포에 대한 세포독성 측정결과, 최대 200 ug/ml 처리시 세포 독성은 나타나지 않았다(Fig. 1).

Fig. 1.MTT assay of ECR Cell toxicity was measured over a 24 h period with a different concentration of ECR (200, 100, 50, 25, 12.5, 6 and 3 ug/ml). The data represent the mean ± SD of four separate experiments.

2. 대식세포 NO 생성 억제 효능 평가

선모 열수 추출물을 50 ug/ml 처리시 NO 생성 억제능은 87.4±3.4%로 유의성 있는 억제 효능이 나타났으며, 100 ug/ml 처리시 NO 생성 억제능은 78.4±4.3%로 유의성 있는 억제 효능을 보였으며, 200 ug/ml 처리시 NO 생성 억제능은 대조군에 비해 70.6±5.8%로 유의성 있는 억제 효능이 나타났다(Fig. 2).

Fig 2.Effects of ECR on nitrite (NO) production in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages for 24 h. The normal group (N) was treated with media only. The control group (Con) was treated with LPS (1 ug/mL) alone. NO production was measured by the Griess reaction assay and expressed as a percentage of the control group. Values are the mean ± SEM of the three independent experiments. *p<0.05 and **p<0.01 vs C.

3. RAW264.7 대식세포 싸이토카인 생성에 대한 억제 효능

대식세포에 ECR을 농도별로 처리한 후, 배양액 내 싸이토카인을 분석한 결과, LPS를 처리한 TNF-α는 대조군에서 32.4±2.1 ng/㎖이었고, ECR을 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖로 처리한 실험군의 생성량은 각각 24.8±3.4, 30.4±2.6, 32.5±4.1 ng/㎖으로 ECR을 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 실험군에서 유의성 있게 감소되었다(p<0.01).

LPS를 처리한 IL-1β는 대조군에서 55.4±6.7 pg/㎖이었고, ECR을 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖로 처리한 실험군의 생성량은 각각 40.8±2.1, 48.7±5.9, 50.3±3.1 pg/㎖으로 ECR을 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 실험군에서 유의성 있게 감소되었다(p<0.01).

LPS를 처리한 IL-6는 대조군에서 137±9.4 pg/㎖이었고, ECR을 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖로 처리한 실험군의 생성량은 각각 80.4±6.7, 100.4±12.4, 119.4±8.7 pg/㎖으로 ECR을 200 ㎍/㎖와 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 실험군에서 유의성 있게 감소되었다(p<0.01, p<0.05).

IL-12는 대조군에서 410.4±25.4 ng/㎖이었고, ECR을 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖로 처리한 실험군의 생성량은 각각 304.1±19.8, 320.4±34.1, 376.4±31.6 pg/㎖으로 ECR을 200 ㎍/㎖와 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 실험군에서 유의성 있게 감소되었다(p<0.01, p<0.05).

PGE2 생성량은 LPS 처리 대조군에서 98.4±4.7 ng/㎖이었고, ECR을 200 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖로 처리한 실험군의 생성량은 각각 69.7±5.7, 82.9±8.4, 90.7±12.4 pg/㎖으로 ECR을 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 실험군에서 유의성 있게 감소되었다(p<0.01)(Fig. 3).

Fig. 3.Effects of ECR on inflammatory cytokines production in LPS stimulated RAW264.7 macrophages for 24 h. The normal group (N) was treated with media only. The control group (C) was treated with LPS (1 ug/mL) alone or with ECR repectively 200, 100 and 50 ug/ml. Cytokine concentrations in the culture medium were measured by a Multiplex bead-based cytokine assay after 24 h incubation. Values are the mean ± SEM of the three independent experiments. *p<0.05 and **p<0.01 vs C.

4. TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA 및 염증성 단백질 발현에 미치는 효능

In vitro 대식세포 실험결과, LPS를 처리한 대조군의 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA 발현이 증가된 반면, ECR 처리군에서는 농도의존적으로 감소되었다. 또한 JNK, ERK, iNOS, COX2, IL-1β 및 TNF-α 단백질 발현량이 LPS를 처리한 대조군에서는 증가되었으며, ECR 처리군에서는 농도의존적으로 감소되었다(Fig. 4).

Fig. 4.Inhibitory effects of ECR on cytokine mRNA and inflammatory protein expression in RAW264.7 cells RAW264.7 cells were cultured with ECR 200 ug/ml, 100 ug/ml and 50 ug/ml plus LPS 1 ug/ml for 6 hrs. RT-PCR was performed by cytoplasmic RNA isolated. Western blot analysis was performed by protein isolated. A：Lane M, 100bp DNA marker；lane 1, LPS (1 ug/㎖)；lane 2, LPS (1 ug/㎖) + ECR (50 ug/ml)；lane 3, LPS (1ug/㎖) + ECR (100 ug/ml) and lane 4, LPS ( 1ug/㎖) + ECR (200 ug/ml) and internal control (b-actin). B：lane 1, basal；lane 2, LPS (1 ug/㎖)；lane 3, LPS (1 ug/㎖) + ECR (100 ug/ml)；lane 4, LPS (1 ug/㎖) + ECR (200 ug/ml) and internal control (GAPDH).

5. 관절염 지수에 대한 영향

콜라겐 유발 관절염 생쥐의 관절염 지수(Arthritic index；AI)를 측정한 결과, 대조군의 AI는 18.2±1.1으로 나타났으며, ECR을 200 ㎎/㎏으로 투여한 실험군의 AI는 13±1.0 (p<0.01), 100 ㎎/㎏으로 투여한 실험군의 AI는 15.7±1.7로 유의성있게 감소되었다 (p<0.05)(Fig. 5).

Fig. 5.Effects of ECR on the arthritis index (AI) in Murine CIA DBA/1J mice were immunized with 100 ㎍ of CII on days 0 and 14. Each sample group was orally adminstrated of ECR (p.o, 200 ㎎/㎏) or ECR (p.o, 100 ㎎/㎏) for 42 days beginning on the day after the first immunization. The AI was calculated from measurement taken the day after the final drug treatment. Each point represents the mean ± S.E of 10 mice. Statistically significant value was compared with control data by Student's t-test (*p<0.05 and **p<0.01).

6. 족관절 면역세포수 및 염증 세포 변화에 대한 영향

관절염 유발 동물의 족관절 내 면역세포수를 측정한 결과, 정상군의 세포수는 4.4±0.9 (×106)였고, 관절염 대조군의 면역세포수는 23.3±3.3 (×106)로 증가되었으며, ECR을 200 ㎎/㎏으로 투여한 실험군의 면역세포수는 18.4±2.1 (×106)로 유의성있게 감소되었으며 (p<0.01), ECR을 100 ㎎/㎏으로 투여한 실험군의 면역세포수는 19.7±2.2 (×106)로 유의성있게 감소되었다 (p<0.05).

혈청 내 염증성 싸이토카인 발현량을 분석한 결과, 정상군에 비해 대조군에서 싸이토카인 발현량이 유의성있게 증가되었고, ECR 투여 실험군에서는 IL-1beta, IL-6 및 TNF-alpha 발현량이 각각 유의성있게 감소되었다(Fig. 6).

Fig. 6.Effects of total paw joint cell number and cytokines (IL-1beta, IL-6 and TNF-alpha) levels in CIA Murine DBA/1J mice Mice were immunized with 100 ㎍ of CII on days 0 and 14. Each sample group was orally adminstrated of ECR (p.o, 200 ㎎/㎏) or ECR (p.o, 100 ㎎/㎏) for 42 days beginning on the day after the first immunization. The cell was harvested from measurement taken the day after the final drug treatment. Each point represents the mean± S.E of 10 mice. Statistically significant value was compared with control data by Student's t-test (*p<0.05 and **p<0.01).

Ⅳ. 고 찰

仙茅는 수선화과(Amarylidaceae)에 속하는 다년생 초본인 仙茅 Curculigo orchioides Gaertn.의 뿌리줄기이다9,10). 仙茅는 性味가 辛溫하고9), 小毒을 지니고 있다9). 仙茅는 補腎陽, 溫脾陽, 强筋骨, 祛寒濕하는 효능을 지니고 있어서, 주로 陽痿精冷, 筋骨痿軟, 腰膝冷痺, 陽虛冷瀉, 小便頻數, 遺尿, 遺精, 崩漏, 복통, 설사, 筋骨不建, 寒濕痹痛의 증상을 치료한다9,10).

그런데, 仙茅는 小毒이 있어서9), 약간의 부작용이나 독성 반응을 일으킬 수 있으므로14), 임상에서 활용할 경우에 주의할 필요가 있는 한약재로 알려져 있다. 仙茅의 약리작용으로는 항혈전 효과15), 면역증강효과16,17), 골조직 신생 및 골 치유효과18), 항B형 간염 바이러스효과19)가 알려져 있다. 또한 仙茅는 초대 배양한 난포의 과립막 세포에서 estradiol(E2)의 농도를 증가시키고20), 사람에서 채취한 정자의 운동성을 증가시킨다21).

仙茅의 성분에 관한 연구를 살펴보면, 仙茅 사포닌은 대식 세포의 增生 능력과 貪食作用을 촉진하며, 면역 기능을 증강한다10). 그 외에 약침에 관한 연구로는 足三里에 대한 仙茅 약침이 골관절염에 효과가 있음이 입증되었다22).

한의학에서는 關節炎을 歷節風, 鶴膝風, 白虎風, 白虎歷節風, 痛風, 痛痺, 痺痛, 痹證, 痺症, 風痺, 痛痺 등의 범주에 속한다고 본다11). 關節炎은 食傷, 勞倦, 痰飮, 瘀血 등으로 氣血이 부족하고, 正氣가 허약해진 상태에서, 風寒濕熱의 邪氣가 침입하여 발생하며12), 관절염의 치료방법으로는 實證의 경우에는 주로 祛風, 散寒, 除濕, 溫通經脈, 淸熱, 化痰祛痰, 活血通絡 등의 방법을 활용하고 있으며, 虛證의 경우에는 調補氣血, 補腎助陽, 滋陰養肝, 補肝腎 등의 방법을 활용하고 있다11,12,13).

Collagen induced arthritis(CIA)는 류머티스 관절염이 발병하였을 때 나타나는 증상과 유사한 증상을 나타내게 되므로, 류머티스 관절염 동물실험의 모델로 개발되어 면역학적 기전과 치료 약물의 약리효과를 밝히는데 많이 이용되는 방법이다8). CIA는 류머티즘 관절염과는 달리, 발병기간이 짧고, 피하결절, 폐섬유종과 같은 합병증이 없으며, rheumatoid factor가 검출되지 않는 차이가 있지만8,23), TNF-α, IL-1, IL-6 등의 염증관련 cytokines는 CIA 진행에 중요한 역할을 한다8,23).

이에 저자들은 補腎陽, 强筋骨, 祛寒濕하는 효능을 지니고 있는 仙茅가 만성 痺痛과 寒濕性 痺痛에 임상에서 활용되고 있는 점에 착안을 하고, 류머티스성 관절염에서 효능을 발휘할 수 있을 것으로 생각하였으며, 또한 어떤 기전을 지니고 효능을 발휘하고 있는 지 CIA 실험 모델을 활용하여 살펴보았다.

먼저, 仙茅 열수 추출물의 세포독성에 대한 영향을 살펴본 결과, 최대 200 ug/ml 처리 시에도 세포 독성은 나타나지 않았다(Fig. 1).

NO(nitric oxide)는 Isoenzymes인 NO 합성효소(NOS)에 의한 L-arginine의 산화에 의해 형성된다24,25). 다양한 세포에서 proinflammatory agents에 반응하여 iNOS의 활성이 증가하면 과도한 염증반응이나 shock를 일으킨다24,25). 대식 세포 NO 생성 억제 효능 평가 실험에서는 선모 열수 추출물을 50 ug/ml, 100 ug/ml 및 200 ug/ml 처리 시 NO 생성 억제능은 대조군에 비해 유의성 있는 억제 효능이 나타났으며, 농도 의존적으로 억제 효능이 우수하였다(Fig. 2). 따라서, 이 실험에서 仙茅 열수 추출물의 CIA에 대한 우수한 효과는 일부 항산화효과에 의하여 매개된 것으로 판단해 볼 수 있다.

TNF-α는 상위 cytokine으로서, 세포성 면역을 활성화하고, 항체 생성을 촉진하는 IL-2, IL-6과 같은 하위염증매개물질의 생성기능을 증가시켜 염증을 증폭시킨다26). IL-1은 면역반응에 중요한 역할을 하는데, 여기에는 막 부착형인 IL-1α와 세포의 분비 형태인 IL-1β의 두 가지가 있다27). IL-1β는 TNF-α에 의해 생성되어서, 연골과 활막세포로부터 prostaglandin E2, NO를 포함한 다른 염증 매개체를 생산하고, MMPs의 발현을 자극하여서 골관절염에서 연골분해를 일으킨다28,29). 염증반응의 경우에 분비되는 친염증성 cytokine인 IL-6은 helper T세포, 대식세포, 비만세포, 중성구, 상피세포, 섬유아세포 등에서 분비되어 면역반응을 조절하고, 조혈, 염증을 조절한다30). 인체에서 염증반응이 진행되면, PGE2와 같은 염증 매개물이 과도하게 생성되어 그 반응을 가속화 시키고, 활성화 된 대식세포는 COX(cyclooxygenase)-2을 활성화시켜 과량의 prostanoid를 생성하여 면역반응에 관여함으로써, 다양한 염증성 질환의 원인이 된다31,32). 본 실험에서 RAW264.7 대식세포 싸이토카인 생성에 대한 억제 효능을 살펴보면, ECR은 200 ㎎/㎏ 仙茅 열수 추출물의 투여군에서 대식세포의 염증성 싸이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-12 발현량을 유의성 있게 감소시켰고, prostagladin E2 생성량을 유의성 있게 감소시켰다. 100 ㎎/㎏ 仙茅 열수 추출물의 투여군에서는 IL-6, IL-12의 발현량을 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 3). 이러한 실험 결과로 볼 때, 仙茅의 처리는 inflammatory cytokines의 분비를 현저히 억제함을 알 수 있어서, 류머티스 관절염에서 초래되는 과도한 면역반응을 억제하는 immunomodulatory 효과에 의해 관절 손실을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

콜라겐 유발 관절염 모델에서는 real-time RT-PCR을 이용하여 mRNA 발현을 측정한 결과, mRNA 발현이 증가한다33). 본 실험에서 ECR은 농도 의존적으로 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 mRNA의 발현을 유의성 있게 감소시켰다. PGE2는 염증반응 시 많은 염증세포들로부터 분비되어 혈관확장, 발열 및 통증을 유발하는 중요인자가 되며, 류마토이드 관절염에서 증가된다34). 특히 adjuvant 유발관절염에서 내인성 PGE2는 IL-6 같은 cytokine의 생산을 자극한다35). 류마티스 관절염 환자의 활막세포에서 신생혈관 생성에 MAPK(ERK；MAP kinase)와 AP-1(activator protein-1)의 신호체계가 중요하다36). ERK1/2, JNK, p38 MAPK는 대표적인 염증신호전달분자로서, LPS와 같은 염증자극에 의해서 염증전사인자인 NF-κB를 핵 내로 이동시켜서 염증반응을 일으켜서 NO, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6과 같은 염증성 물질의 합성과 분비를 유도한다37). 또한 류머티스 관절염 환자 의 활막세포에서는 iNOS, COX2의 활성이 증가한다38). 본 실험에서 콜라겐 유발 관절염 모델에서는 JNK, ERK, iNOS, COX2, IL-1β 및 TNF-α 단백질 발현량이 LPS를 처리한 대조군에서는 증가되었으나, ECR은 농도 의존적으로 단백질 발현량을 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 4).

콜라겐 유발 관절염에서는 관절염 지수(AI)가 증가된다13). 이 실험에서 콜라겐 유발 관절염 생쥐의 관절염 지수(AI)를 측정한 결과, ECR을 200 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏으로 투여한 실험군의 AI는 모두 유의성 있게 감소되었다(Fig. 5). 이러한 결과는 仙茅 약물 처리로 인해 관절염의 악화가 진행되지 않았음을 의미한다.

CIA 실험 모델에서, paw joint에서 면역세포의 수는 대조군에서 현저하게 증가하는 것으로 알려져 있다39). 본 실험에서도 족관절 면역세포수는 CIA 모델에서 현저하게 증가하였으나, ECR은 200 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏ 투여군 모두에서 족관절 부위 면역세포수를 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 6). 류머티스 관절염은 전신적 면역체계의 활성화에 의해서 발생하며, CIA 실험 모델에서 혈청 중의 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성이 현저하게 증가한다40,41). 본 실험에서는 ECR 200 ㎎/㎏과 100 ㎎/㎏ 투여군 모두에서 혈청 내 IL-1β, IL-6, TNF-α의 싸이토카인 분비량을 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 6).

이상의 실험 결과에서, 100 ㎎/㎏ 이상의 仙茅 熱水 추출물은 immune modulatory 작용에 의해서, CIA를 매우 효과적으로 억제하는 것으로 관찰되었으므로, 향후 생리활성을 나타내는 성분의 규명과 다양한 약효기전의 연구를 통하여, 새로운 류머티스 관절염 치료제로서 개발에 仙茅를 적극적으로 활용해 볼 필요가 있을 것으로 생각된다.

Ⅴ. 결 론

仙茅 熱水 추출물의 대식세포에 대한 항염증 효능과 콜라겐유발 관절염 유발에 대한 효능 연구를 위해, 염증성싸이토카인 발현량 분석, mRNA 발현량 및 단백질 분석과 관절염지수, 관절 내 면역세포수 분석 및 혈청 내 염증성 싸이토카인 발현을 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.

이상의 결과로, 仙茅 熱水 추출물은 항염증 효능이 우수하며, 이를 통해 대식세포에 대한 항염증 효능과 콜라겐 유발 관절염에 대한 치료 효능을 통해 향후 관절염 치료제로서 개발 가능성이 있다고 판단된다.