서 언

피나무속(Tilia L.)은 아욱과(Malvaceae)에 속하는 식물로 주로 온대지방 북반구에 분포하며, 미국동부에 3분류군, 멕시코 고산지방에 1분류군, 유럽에 5분류군, 동북아시아에 30-40 여분류군이 분포하고 있다(Shishkin, 1974). 국내에는 9종이 자생, 2종이 식재되고 있는 것으로 알려져 있다(Kim and Chung, 1983; Kim and Chung 1986).

국내 자생 피나무속 식물에 대한 분류학적 연구는 Schneider (1909)가 뽕잎피나무(T. taquetii Schineid.)를 기재하고, Nakai (1909)가 찰피나무(T. mandshurica Rupr. & Maxim.)와 피나무(T. amurensis Rupr.)의 분포를 보고하면서 시작되었다. 그 후 Nakai (1914)는 피나무, T. glabrata Nakai, 연밥피나무(T. koreana Nakai), 찰피나무, T. maximowiczii Baker f., 염주나무(T. megaphylla Nakai), 개염주나무(T. semicostata Nakai), 뽕잎피나무의 국내 분포 보고 하였으며, 1922년에 피나무, 꽃피나무(T. amurensis for. polyantha Nakai), 평안피나무(T. amurensis var. grosserrata Nakai), 섬피나무(T. insularis Nakai), 연밥피나무, 찰피나무, 웅기피나무(T. ovalis Nakai), 털피나무(T. rufa Nakai), 개염주나무, 뽕잎피나무 등 9종 1변종 2품종이 분포하는 것으로 보고하고 1952년에는 9종 5변종 3품종이 분포하는 것으로 재발표하였다. 이후 Chung (1957)은 9종 2변종으로 Lee (1996a)는 11종 1품종, Lee (1996b)는 11종3품종으로 보고 하였다. 현재는 피나무속 분류군의 분류와 종간변이한계와 분포를 연구한 Kim (1983)의 견해를 따라 국내에 피나무, 섬피나무, 연밥피나무, 찰피나무, 염주나무, 웅기피나무, 털피나무, 개염주나무, 뽕잎피나무, 보리자나무(T. miqueliana Maxim.), 구주피나무(T. kiusiana Makino & Shiras.) 11종이 분포하고 있는 것으로 보는 것이 일반적이다. 그 중 구주피나무는 일본원산으로 밀원자원으로 도입하여 식재되고 있으며(Choi, 1987), 보리자나무는 중국원산으로 국내 사찰에 주로 분포하고 구 홍릉임업시험장에 식재된 개체 등 상당수가 일본으로 도입되어 들어온 기록으로 보아 식재종으로 판단된다(Kim and Chung, 1986).

본 속은 겨울눈, 신년지, 포, 화경 성모의 유무, 한 화서에 달리는 꽃의 수, 열매의 능각의 발달 정도 등이 주된 형태적 식별 형질로 사용되었다(Nakai, 1914; Nakai, 1922; Nakai, 1952). 하지만 이러한 형질은 각 분류군에서 연속적인 변이로 나타나 분류군의 한계를 명확히 규정하기에 어렵다(Yoon, 2003). 따라서 Liou (1955)는 피나무에 비해 잎의 크기가 작고 3-5개의 꽃이 화서에 달리는 특징을 가진 뽕잎피나무를 피나무의 변종으로 처리하였으며, Yoon (2003)은 섬피나무와 뽕잎피나무를 피나무와 동일한 분류군으로 주장하는 등 현재에도 본 속의 분류군간 한계설정에 대한 이견이 많은 실정이다(Yoon, 2003; Liou and Li, 1955; Pigott, 2008).

nrDNA의 ITS (Internal transcribed spacer) region은 양친 유전을 하며 다른 coding region보다 더 빠르게 진화하여 유전자간의 변이성이 높은 편으로 종간의 유연관계와 진화경향성 및 유전변이 양상을 파악하는데 유용한 것으로 알려져 있다(Álvarez and Wendel, 2003). 또한 모계 유전을 하는 cpDNA의 non-coding region은 유전자보다 빠르게 진화하고 염기치환과 같은 비율로 indel이 축적되므로 분류군의 유연관계 파악에 중요한 자료로 이용되고 있다(Cai et al., 2015; Kim et al., 2016).

따라서 본 연구는 잎의 크기, 성모의 색상, 열매의 능각의 유무 등을 식별형질로 피나무와 구분하고 현재 분류학적 위치에 대하여 이견이 분분한 섬피나무, 털피나무, 뽕잎피나무, 연밥피나무간의 유연관계를 알아보고자 하였으며 함경도에 자생하는 웅기피나무와개염주나무를 제외한한국과 일본의 피나무속 10종을 대상으로 nrDNA-ITS, rpl32-trnL 및 trnL-F 염기서열에 근거하여 피나무속의 분류학적 특성과 분류군간 근연관계를 살펴보고자 하였다.

재료 및 방법

실험 재료

본 연구에서 사용된 재료는 원기재문을 기준으로 동정하였다. 직접 채집한 식물체는 영남대학교 식물표본관에 확증표본으로 보관하였으며, 국립수목원(KH), 강원대학교 식물표본관(KWNH)의 건조표본을 포함해 한국산 피나무 9종을 사용하였다. 그리고 일본 홋카이도대학교 식물표본관(SAP)의 구주피나무, 일본피나무(T. japonica (Miq.) Simonk.)를 포함하여 피나무속 총 10종 26개체를 사용하였다. outgroup으로는 근연관계 멕시코목화(Gossypium hirsutum L.)의 GenBank 자료를 사용하였다(Table 1).

Table 1.Sample information and GenBank accession numbers of Tilia taxa used in this study

DNA추출 및 PCR 증폭

자생지에서 직접 채집한 생체 및 표본관에 수장 중인 건조표본에서 채취한 시료를 Precellys®24 Homogeniser (Bertin Technologies, France)를 이용하여 파쇄시킨 후, Dolye and Doyle (1987)의 CTAB 방법을 수정한 Loockerman and Jansen (1996)의 방법으로 total DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 1.2% agarose gel 상에서 전기영동 후, EtBr 염색법으로 UV 조명아래서 형광 밝기를 상대 비교하고 흡광도를 측정하여 농도를 확인하였다. ITS region의 증폭은 primer ITS4와 ITS5 (White et al., 1990)를 이용하였으며, trnL-F region의 증폭은 primer C와 primer F (Taberlet et al., 1991)를 이용하였다(Table 1). 또한 rpl32-trnL의 partial region을 primer 400F와 trnL-R (modified from Shaw et al., 2005) 이용하여 증폭하고 분석하였다(Table 1). 각 region의 증폭을 위한 PCR 반응용액의 조성은 주형 DNA 20−50 ng, 10× DiastarTMTaq DNA Buffer 2.5 μL, 10 mM의 dNTPs 0.5 μL, 10 pmol의 primer를 각각 1 μL, 2.5 unit의 DiastarTMTaq DNA Polymerase 0.13 μL (SolGent Co., Korea)를 첨가 후 마지막으로 전체 부피가 25 μl가 되도록 하였다(Table 2). DNA증폭을 위한 PCR반응은 다음과 같이 수행하였다. PCR의 첫 cycle에서는 1차적으로 DNA를 완전히 denaturation시키기 위해서 94℃에서 5분 동안 predenaturation 후, 2차적으로 94℃에서 1분 denaturation, primer annealing은 primer에 따라 50℃~58℃에서 40초 annealing, 72℃에서 1분 extension으로 구성된 반응을 30회 반복한 후, 최종적으로 72℃에서 10분간 extension 하였다.

Table 2.Primer sequences for DNA markers used in this study

염기서열 및 분자계통학적 분석 증폭된 산물의 염기서열은 forward와 reverse방향으로 각각 해독하고 이들 단편들의 염기서열은 Genious pro ver. 6.1.8로 조합하였으며, ClustalW을 이용하여 정렬하였다. 정렬결과 발생한 gap은 결여형질(missing character)로 처리 하여 모든 형질에 같은 가중치를 부여하였다. 염기서열 간의 유전적 거리(Kimura’s 2 parameter방법) 계산과 Maximum parsimony (MP), Maximum-likelihood (ML) 분석은 MEGA 6.06을 이용하여 수행하였다. ML분석은 Modeltest ver 3.7 (Posada and Crandall, 1998)을 이용하여 적정모델을 선정하였으며, hLRTs의 기준을 적용하였다. MP분석은 heurestic search를 이용하였으며, option으로 1000회 random addition sequence와 TBR branch-swapping algorithm을 적용하였다. 또한 각 분계도의 신뢰도를 구하기 위하여 무작위로 1000회 반복하여 bootstrap value (Felsenstain, 1985)를 구하였으며, Consistency Index (CI: Kluge and Farris, 1969)와 Retention Index (RI: Farris, 1989)는 MEGA 6.06로 구하였다. ITS region과 trnL-F, rpl32-trnL의 combined data로서의 적합성을 판단하기 위하여 ILD (Inconrruence Length Difference) test를 수행하였다.

결 과

염기서열의 분석

피나무속 각 분류군의 DNA marker 부위별 염기서열의 길이와 G+C 함량은 Table 3에서 나타내었다. 피나무속 ITS region의 염기서열은 687-691 bp로 나타났으며, 섬피나무, 연밥피나무, 일본피나무가691 bp로 가장 길게 나타났으며 피나무, 뽕잎피나무, 털피나무, 구주피나무가 687 bp로 가장 짧았다. DNA구조에 영향을 미치는 G+C 함량은 55.9-60.5%로 나타났다. trnL-F region의 염기서열은 954-976 bp로 나타났으며, 구주피나무가 976 bp로 가장 길었다. trnL-F region의 G+C 함량은 28.4-29.0%로 나타났으며, G+C 함량이 가장 높은 분류군은 T. kiusiana확인되었다. rpl32-trnL region의 염기서열은 823-825 bp로 나타났으며, G+C 함량은 24.5-25.1%로 나타났다. nrDNA의 ITS region, cpDNA의 trnL-F, rpl32-trnL을 유합한 Combined data의 정렬된 염기서열에 관하여 Kimura’s 2 Parameter method (Kimura, 1980)를 이용한 종간 유전적 거리(Pairwise Distance)를 계산한 결과 구주피나무와 연밥피나무에서 0.011로 가장 높게 나타났다(Table 3).

Table 3.Sizes and G+C contents of DNA markers used in this study

분자계통학적 분석

본 연구에 사용된 nrDNA의 ITS region, cpDNA의 trnL-F, rpl32-trnL, ITS와 rpl32-trnL 염기서열을 유합한 data (Combined Ⅰ), ITS, trnL-F와 rpl32-trnL을 유합한 data (Combined Ⅱ) 각각의 parsimony informative character를 Table 4에 정리하여 나타내었다. Total length는 Combined Ⅰ에서는 1510-1515 bp, Combined Ⅱ는 2466-2486 bp로 나타났다. ITS의 CI (Consistency Index) 값은 0.83이였으며, RI (Retention Index) 값은 0.94로 나타났다. ITS와 rpl32-trnL을 유합한 data (Combined Ⅰ)의 CI 및 RI값은 각각 1로 나타났다. ITS와 trnL-F, 그리고 rpl32-trnL을 유합한 data (Combined Ⅱ)의 CI 및 RI값은 각각 0.80과 0.92로 나타났다(Table 4).

Table 4.Values and statistics of the data matrixes

분류군간 ITS region의 maximum-parsimony tree 에서 구주피나무는 단계통군을 형성하였으며, outgroup과 유연관계가 가장 가깝게 나타났다. 일본에 자생하는 구주피나무개체는 96%의 bootstrap values로 독립된 분계조를 형성하여 한국에 식재되고 있는 개체와 차이를 보여주었다(data not shown). 찰피나무, 보리자나무, 염주나무가 한 분계조를 구성하였으며, 그 피나무, 뽕잎피나무, 털피나무가 75% bootstrap values로 섬피나무, 일본피나무, 연밥피나무는 82% bootstrap values로 각 분계조를 형성하였다(data not shown). cpDNA marker인 trnL-F의 MP tree 에서는 구주피나무와 연밥피나무두 종만이 독립된 분계조를 형성하였으며, rpl32-trnL의 MP tree 에서는 구주피나무, 연밥피나무, 일본피나무가 단계통군을 형성하였다(data not shown). 나머지 7 분류군은 59% bootstrap value로 분계조를 형성하였으며, 이 중 피나무와 섬피나무가 72% bootstrap value로 유집되었다(data not shown).

ITS와 rpl32-trnL 염기서열을 유합한 Combined I과 ITS, rpl32-trnL, trnL-F의 염기서열을 유합한 Combined II의 p-value는 0.05이상으로 나타났다. 두 Combined data의 MP tree와 ML tree는 동일한 topology를 나타내었다. Combined II의 MP tree는 6개의 분계조로 구성되어 있었다(Fig. 1). Clade 1은 구주피나무로 outgroup과 유연관계가 가장 가깝게 나타났다. 나머지 9종은 96%의 bootstrap values로 분계조를 이루었다. 100% bootstrap value로 보리자나무, 찰피나무, 염주나무가 Clade 2를 구성하였다. 피나무, 뽕잎피나무, 털피나무가 79% bootstrap value로 Clade 3으로 구성되었으며, 피나무는 78% bootstrap value로 분계조를 형성하였다. 연밥피나무, 일본피나무와 섬피나무는 각각 Clade 4, 5, 6을 형성하였으며, 55% bootstrap values로 하나의 분계조를 형성하였다. 그 중 섬피나무는 일본피나무와 근연관계에 위치하였다. ML tree도 6개의 분계조로 구성되었으며, MP tree와 같이 구주피나무단계통군을 형성하였다. 피나무, 털피나무, 뽕잎피나무는 Clade 3을 구성하였으며 찰피나무, 보리자나무, 염주나무로 구성된 Clade 2가 Clade 4, 5, 6과 하나의 분계조를 형성하였다(Fig. 1).

Fig. 1.Phylogenetic relationships of Tilia based on the combined data.

고 찰

엽신과 일년지에 성모가 발달하지 않는 피나무속 분류군은 Anastraea절에 속하며 본 연구에서 피나무, 뽕잎피나무, 털피나무, 연밥피나무, 섬피나무, 일본피나무, 구주피나무가 이에 포함된다. 엽신의 폭이 매우좁은 난형의 형태를 가진 구주피나무을 제외한 나머지 6종은 외부형태학적으로 종을 구분하는 유용한 형질을 찾는데 어려움이 많다. 실험 결과 염기서열 및 염기 조성은 속내에서 큰 차이점이 나타나지 않았다.

MP분석에서 구주피나무가 단계통군을 형성하며 outgroup과 가장 가깝게 나타났다(Fig. 1). Anastraea절의 다른 분류군과 다르게 형태적으로 난형의 엽형을 가지고 있으며, 유사한 외부형태를 가지는 종이 없어, 독립된 종으로 판단된다. 피나무, 뽕잎피나무와 털피나무는 잎의 크기와 하나의 화서에 달리는 꽃의 수, 엽병의 단모의 유무에 따라 구분하고 있다. 이러한 형질은 종을 구분하기에 다소 모호하여 Liou (1955)는 뽕잎피나무를 피나무의 잡종으로 주장하였으며, Pigott (2008)은 뽕잎피나무와 털피나무를 피나무의 아종으로 처리하는 등 세 종의 분류학적 한계가 불분명하다. 본 연구에서 피나무는 형태적으로 잎의 크기와 화서에 달리는 꽃의 수, 엽병의 단모의 유무에 있어서 연속적인 변이가 있었으며, 염기서열 분석결과 피나무는 뽕잎피나무와 털피나무와 유집되어 세 분류군의 유연관계는 가까운 것으로 판단된다(Fig. 1). 이러한 결과는 뽕잎피나무와 털피나무가 고도와 지리적 차이에 의한 피나무의 아종일 가능성이 크다는 Pigott (2012)주장을 지지 하였다. 전반적인 외부형질이 피나무와 유사하지만 열매에 능각이 있으며 서양배 모양의 특징을 가진 연밥피나무에대하여 Pigott (2012)은 T. amurensis subsp. taquetii의 이명으로 처리하였다. 하지만 실험결과 연밥피나무는 독립적인 분계조를 형성하였으며, 피나무보다 섬피나무, 일본피나무와 근연관계를 보여주었다. 또한 형태형질 중 열매모양 뿐만 아니라 원형의 피목을 갖는 특징으로 피나무와 차이가 있었다. 일본피나무는 피나무에 비해 화경의 길이가 길고 5개의 헛수술을 가진다는 차이점이 있다(Pigott, 2012). 계통수에서도 피나무와 다른 분계조에 위치하였으며, 연밥피나무 및 섬피나무와 가까운 유연관계를 보여주었다(Fig. 1). 울릉도 특산식물인 섬피나무는 일부학자에 의해 피나무와 동종이라는 견해(Yoon, 2003 and Pigott, 2008)가 있으나, 본 염기서열분석결과에서 섬피나무는 단계통군을 형성하며, 일본피나무와 가까운 관계를 보여주었다(Fig. 1). 형태적으로 잎 전면 맥 위 암갈색 방추형 단모가 밀집하는 특징이 일본피나무와 함께 관찰되었으며, 이러한 형질은 피나무와 구분되었다. 식물체 전체에 높은 밀도의 성모의 특징을 가진 Astrophilyra절에 속하는 보리자나무, 찰피나무, 염주나무는 형태적으로 헛수술과 수술의 길이 차이, 열매능각으로 구분하지만 염기서열분석결과 비 단계통군으로 하나의 분계조를 구성하였다. 세 종이 독립된 종인지 판단할 수 없었으나 서로 가까운 근연관계에 있음을 확인하였다(Fig. 1). 본 계통학적 연구결과 섬피나무, 일본피나무, 연밥피나무, 피나무, 구주피나무가 단계통군을 형성하였으며 털피나무, 뽕잎피나무, 보리자나무, 찰피나무, 염주나무의 경우 독립된 분계조를 나타내지 않아 이들의 분류학적 실체에 대해서는 다른 marker를 이용한 추가적인 연구가 수행되어야할 것으로 생각된다.

본 연구는 nrDNA의 ITS region과 cpDNA의 trnL-F, rpl32-trnL region 염기서열을 분석하여 한국산 피나무속(Tilia)식물의 계통학적 유연관계를 파악하고자 하였다. 섬피나무는 피나무와 다른 분계조를 형성하며, 일본피나무와 좀 더 가까운 유연관계에 있음을 확인할 수 있었다. 피나무와 비교하여 열매에 결각이 발달하고, 원형의 피목을 갖는 연밥피나무는 독립적인 분계조를 형성하여 피나무와 차이를 확인할 수 있었다.