I. 서 론

1. 연구의 필요성

물리·화학적 자극이나 미생물 감염 등에 기인하여 발생하는 조직의 손상을 복구하기 위한 반응을 염증이라고 한다(Lawrence 등, 2002). 염증이 유발되면 다양한 면역세포의 작용으로 대부분 급성의 상태에서 치유되지만 간혹 만성 염증으로 이행하는 경우 여러 조직이나 장기에 손상을 초래하기도 한다(Kundu & Surh, 2008). 그러므로 염증 반응을 초기에 줄이는 것이 중요하고 이를 위하여 많은 종류의 항염증제가 개발되어 사용되고 있으나 부작용 또한 많이 보고되고 있는 것이 사실이다(Kundu & Surh, 2008). 따라서 이러한 부작용을 막기 위한 천연물 유래 항염증제의 개발이 지속적으로 시도되고 있다(Surh, 2003). 치주질환은 치주염과 치은염으로 분류되고, 잇몸에 발생하는 염증인 치은염이 악화되어 치아 주변 조직까지 염증이 번지는 치주염으로 발전하는 질환이다(Petersen & Ogawa, 2012). 특히, 치주질환은 구강 내에 상재하는 세균에 의해 자주 발생하고 그 중 Porphyromonas gingivalis가 주요 원인균인 것으로 보고되고 있다(Armitage, 1999; Hajishengallis & Lamont, 2014). 치주질환 병소에서 증식하고 열구상피에 침투하는 그람 음성 혐기성 간균인 P. gingivalis는 여러 염증성 대사산물을 생성함으로써 치주조직에 손상을 입히고 이 과정에서 치주조직의 파괴와 치조골의 재흡수가 유발되어 치아가 상실되기도 한다(Noda, 2007; Sreenivasan & Gaffar, 2008). 세균 세포벽의 내독소인 lipopolysaccharide (LPS)는 숙주의 면역세포의 자극을 유발하여 염증 반응을 시작한다(Graves 등, 2001; Kocgozlu 등, 2009). 치주조직을 구성하는 세포 중 하나인 치은섬유모세포 (human gingival fibroblast)는 P. gingivalis로부터 분리된 내독소인 LPS에 반응하여 여러 염증매개물질을 생성하는 것으로 보고되어 있으므로 이들 염증매개물질들의 활성을 조절하는 것이 치주조직 염증 반응 억제에 중요한 과정이라고 생각할 수 있다(Li 등, 2017).

천연물 유래 생리활성 물질을 탐색하기 위한 연구가 꾸준히 진행되고 있고 그 중 해조류의 항염증능에 관한 연구 또한 다양하게 시도되고 있다(Juárez-Portilla 등, 2019). 해조류는 섬유질, 미네랄, 비타민이 풍부하여 다양한 식재료로 활용되고 있고 항염(Kang 등, 2014), 항산화(Kim 등, 2015), 항암(Kim 등, 2001), 면역조절(Jung 등, 2002), 항균 (Kim 등, 2016) 등 여러 생리활성기능이 있는 것으로 보고되고 있다. 그 중 홍조류인 잎꼬시래기(Gracilaria textorii)는 우리나라의 제주도 및 남해안, 동해안에 넓게 분포하고 있고, 그러나 생쥐대식세포에서의 항염활성(Kim 등, 2018)을 제외한 잎꼬시래기의 생리활성에 관해서 보고되지 않고 있다. 

2. 연구의 목적

본 연구에서는 치주조직의 구성세포 중 하나인 사람치은섬유모세포에서 잎꼬시래기의 항염증 활성과 항산화 활성을 검증하여 천연 생리 활성소재로의 다양한 활용을 위한 기초자료로 삼고자 한다.

II. 연구방법

1. 시료

잎꼬시래기 에탄올 추출물(G. textorii ethanol extract; GTEE)은 제주 생물종다양성연구소(Jeju, Korea)에서 분양받아 연구에 활용하였다. P. gingivalis로부터 분리된 LPS (LPS-PG)는 Invivogen(San Diego, CA, USA)에서, bovine serum albumin, skim milk는 Bio-Rad(Hercules, CA, USA)에서, dimethyl sulfoxide는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다.

2. 세포배양 

실험에 사용한 인간 치은섬유모세포인 HGF-1 cell은 ATCC (CRL-2014; Rockville, MD, USA)에서 구입하여 10 % fetal bovine serum(Hyclone, South Logan, UT, USA)과 1 % antibiotics(100 U/ml penicillin G, 100 μg/ml streptomycin, Hyclone)을 첨가한 DMEM 배지로 37 ℃, 5 % CO2에서 배양하였다.

3. 세포생존율 

HGF-1 세포의 생존율은 24 well plate에 5×104cell/well의 농도로 분주하고 37 ℃, 5 % CO2 배양조건에서 24시간 배양 후 50, 100, 250, 500 μg/ml 농도로 GTEE를 처리하고 2시간 후 LPS-PG를 1 μg/ml의 농도로 처리한 후 22시간 배양하였다. 배양 후 EZ-Cytox cell viability assay kit(Daeil Lab Service, Seoul, Korea)을 사용하여 well당 EZ-Cytox 시약 10 μL를 첨가한 후 1시간 배양하고 microplate reader(Benchmark Plus, Bio-Rad)를 이용하여 480 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4. NOS 활성 억제 효과

HGF-1 세포를 6-well plate에 2×105 cell/well 농도로 분주하고 24시간 배양하여 부착하였다. 부착된 세포에 50, 100, 250, 500 μg/ml의 농도로 GTEE를 처리하고 2시간 배양 후 LPS-PG를 1 μg/ml의 농도로 처리하고 10시간 동안 배양하였다. 세포 추출물로부터 NOS의 활성을 분석하기 위하여 5 μg/ml pepstatin A, 1 μg/ml chymostatin, 5 μg/ml aprotinin, 100 μM phenyl methyl sulfonyl fluoride가 포함된 40 mM Tris buffer(pH 8.0) 0.1 ml의 lysis buffer에 세 번의 냉동과 해동을 번갈아가며 세포를 용해하였다. 단백질의 농도는 Bradford 법으로 분석하였다. NOS 효소 활성분석은 4 μM FAD, 4 μM tetrahydrobiopterin, 3 mM DTT, 2 mM L-arginine과 NADPH가 포함된 20 mM Tris–HCl(pH 7.9)에 20 μg의 단백질을 넣고 3시간 동안 37 °C에서 가온한 한 후 Griess reaction을 이용하여 다음과 같이 비색법으로 분석하였다(Vodovotz 등, 1993). 세포 추출액 100 μl와 Griess시약 100 μl를 동량 혼합하여 37 °C에서 10분 반응한 후 multiplate reader(Bio-Rad)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였고, NaNO2로 표준곡선 작성 후 NO의 농도를 계산하였다

5. Western blot 분석

HGF-1 cell을 100 mm dish에 2×106cells/dish의 농도로 파종하여 24시간 동안 배양한 후 GTEE를 농도별로 처리하고 2시간 배양하였다. 그 후 LPS-PG를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 24시간 동안 다시 배양하였다. 시료 처리가 끝난 세포는 0.1 ml의 PRO-PREP (Intron Biotechnology, Seongnam, Korea)으로 단백질을 추출하였다. PRO-PREP은 13,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하고 분리된 상층을 새 튜브로 옮긴 후 단백질 농도는 Bradford법으로 정량하였다. 추출 단백질 50 μg으로 시료 준비후 10 % SDS-polyacrylamide gel에 전기영동 하고 polyvinylidene fluoride membrane(PVDF, Bio-Rad)으로 단백질을 이동시켰다. PVDF membrane은 5 % skim milk를 TBST에 녹인 용액으로 실온에서 2시간 동안 블로킹 반응을 진행하였다. 그리고 1:100∼1,000의 비율로 희석한 1차 항체와 섞은 후 4 ℃에서 24시간 동안 반응을 진행하였다. 1차 항체인 iNOS, COX-2, phospho-p65, NQO1과 2차 항체인 horseradish peroxidase(HRP)-conjugated anti-rabbit IgG 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Dallas, TX, USA)와 Cell Signaling Technology(Boston, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체와의 보합반응이 끝난 PVDF membrane은 2차 항체와 실온에서 2시간 동안 hybridization반응을 하였고 그 후 enhanced chemiluminescence 시약(Santa Cruz Biotechnology)을 이용하여 ECL film (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)에 감광시켜 단백질의 발현 변화를 측정하였고 Gel Doc EQ system (Bio-Rad)으로 정량하였다.

6. 통계 분석

3회 반복 시행한 모든 실험 결과는 SPSS 통계 프로그램(version 25.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균±표준편차(mean ±SD)로 나타내었다. 실험군 간의 유의성 검증에는 일원배치 분산분석(one-way ANOVA)을 이용하였고, Duncan's multiple range test 방법으로 사후 검증을 시행하였다. 

III. 결 과

1. HGF-1 세포에서 GTEE의 염증 억제 효과

GTEE의 처리가 HGF-1 세포의 생존에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 50, 100, 250, 500 μg/ml 농도의 GTEE를 2시간 동안 처리한 후 LPS-PG(1 μg/ml)를 24시간 동안 처리하였다. 그리고 WST assay로 세포 생존율을 분석한 결과 본 실험에 사용한 농도의 범위에서는 세포독성이 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig 1). 

Fig 1. Effect of GTEE on cell viability in LPS-PG-stimulated HGF-1 cells.
HGF-1 cells (5×104/plate) in 24-well plates were preincubated with and without indicated concentrations of GTEE for 2h, and then incubated with LPS-PG (1 μg/ml) for 24h. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

GTEE가 LPS-PG에 의해 유도된 HGF-1 세포의 염증 억제에 효과를 보이는 지의 여부를 확인하기 위하여 iNOS와 COX-2의 발현을 western blot으로 분석하였다. 그 결과 Fig 2에서 보는 바와 같이 LPS-PG에 의해 발현량이 증가된 iNOS와 COX-2는 50, 100, 250, 500 μg/ml의 농도로 GTEE를 처리함에 따라 농도 의존적으로 이들의 발현을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 그리고 Griess reaction으로 분석한 세포내 NOS의 활성 또한 GTEE의 처리에 따라 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig 3). 

염증 매개물질의 전사인자인 NF-κB와 AP-1의 활성을 분석하기 위하여 p65와 c-jun의 인산화 정도를 western blot으로 분석하였다. Fig. 4에서 보는 것과 같이 LPS-PG에 의해 유도된 p65의 인산화가 GTEE의 처리에 의해 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로 미루어보아 GTEE는 LPS-PG에 의해 유도된 HGF-1 세포의 염증 반응을 NF-κB와 AP-1의 활성을 억제함으로써 조절한다는 것을 알 수 있었다. 

Fig 2. Effect of GTEE on protein expression of LPS-PG-induced inflammatory mediators in HGF-1 cells. 
Protein expression levels of iNOS and COX-2 by GTEE were analyzed by western blot analysis. All signals were normalized to protein levels of actin, an internal control, and expressed as a ratio. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test. 

Fig 3. Effects of GTEE on NOS enzyme activity in LPS-PG-stimulated HGF-1 cells
Cells were seeded in 100-mm dish (2×106cells/dish) and preincubated with various doses of GTEE for 2h. Then, 1 μg/ml of LPS-PG was added and incubated for 10h for NOS induction. The NOS enzyme activity in cell lysates was detected by Griess reaction. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

Fig 4. Effect of GTEE on protein expression of inflammatory transcription factors in LPS-PG-stimulated HGF-1 cells. 
Phosphorylated status of  p65 and c-jun by GTEE was analyzed by western blot analysis. All signals were normalized to protein levels of actin, an internal control, and expressed as a ratio. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

2. NQO1 발현을 통한 GTEE의 항산화 효과

발현이 유도된 2상 효소(phase II enzyme)를 통해 염증 조절이 가능한 보고를 토대로 본 실험에서도 2상 효소 중 하나인 NQO1의 발현을 분석하였다(Yang 등, 2015). Fig 5에서 보는 것처럼 GTEE의 처리에 의하여 NQO1의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었고 또한 2상 효소의 전사인자인 Nrf-2의 활성 또한 농도 의존적으로 유도되는 것을 확인하였다. 본 연구의 결과 GTEE는 LPS-PG에 의해 유도된 HGF-1 세포의 염증을 전사인자인 NF-κB의 인산화 억제를 통해 염증 매개물질을 조절하고, Nrf-2의 활성 유도를 통해 NQO1의 발현 증가를 유도함으로써 염증을 억제하는 것을 알 수 있었다.

Fig 5. Effect of GTEE on protein expression of NQO1 and its transcription factor, Nrf-2, in LPS-PG-stimulated HGF-1 cells. 
Protein expression levels of NQO1 and Nrf-2 by GTEE were analyzed by western blot analysis. All signals were normalized to protein levels of actin, an internal control, and expressed as a ratio. Data represent the mean±SD of triplicate experiments. Values sharing the same superscript are not significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

IV. 고 찰

세균의 내독소인 LPS의 자극으로 인한 염증이 발생하면 대식세포에서는 NO, PGE2, TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 염증 매개물질을 분비한다. 이 중 L-arginine이 iNOS에 의해 대사되어 생성되는 NO, COX-2에 의한 arachidonic acid 대사물질인 PGE2가 과량 생성되는 경우 조직의 손상, 유전자 변이, 만성 염증 등 다양한 손상을 초래한다(Lee 등, 2011; Na & Surh, 2006; Nathan, 1992). 치주조직을 구성하는 세포 중 하나인 HGF-1 세포는 TNF-α, IL-1β과 같은 염증매개물질의 처리에 의해 NO가 증가되었고, 치주염 동물 모델에서 동일한 결과를 확인할 수 있었다. COX-2 또한 치주염 동물 모델에서 발현이 증가되었고, 이의 억제를 통해 치주염을 조절할 수 있다는 사실 또한 보고되었다(Daghigh 등, 2002; Holzhausen 등, 2002). 그러므로 HGF-1 세포에서 LPS-PG에 의해 유발된 염증을 억제할 수 있는 물질은 치주염을 조절할 수 있는 활성을 가진 것으로 생각할 수 있다. 본 연구에서는 LPS-PG로 유도된 HGF-1 세포의 염증에서 GTEE의 항염증 효과를 분석하고자 하였다. GTEE는 HGF-1 세포에서 500 μg/ml의 농도까지 세포독성을 나타내지 않았다. LPS-PG 자극으로 과발현된 iNOS와 COX-2의 발현을 농도 의존적으로 억제하였다. 그리고 세포내 단백질 추출 후 NOS의 활성을 분석한 결과 또한 iNOS의 결과와 같은 양상을 보여주었다. 

NF-κB와 AP-1은 염증과 면역 반응과 관련된 다양한 유전자의 발현을 조절하는 전사인자이다. NF-κB는 세포질 내 p50과 p65가 IκB에 결합된 heterodimer의 형태의 비활성형으로 존재하다가 염증성 자극으로 IκB가 인산화되면서 p50과 p65가 활성형으로 변화게 되고 이때 p65도 인산화된다. 그리고 AP-1은 세포질에 c-jun과 fos의 dimer 형태의 불활성형으로 존재하다가 염증성 자극으로 c-jun이 인산화되면서 활성형으로 바뀐다. 활성화된 NF-κB와 AP-1는 핵내로 이동한 후 염증매개물질인 iNOS, COX-2의 전사를 촉진시킨다(Surh, 2003). 그러므로 NF-κB와 AP-1의 활성 조절을 통해 염증 매개물질을 억제할 수 있으면 치주염을 포함한 여러 염증 관련 질환의 치료에 효과적인 후보물질이 될 수 있을 것으로 생각한다. 본 연구에서 염증 관련 전사인자인 NF-κB와 AP-1의 인산화 정도를 분석한 결과 GTEE에 의해서 NF-κB와 AP-1의 subunit인 p65와 c-jun의 활성이 유의적으로 감소하였고 GTEE는 NF-κB와 AP-1의 활성을 조절함으로써 HGF-1 세포의 염증을 억제하는 것으로 생각된다.

정상 생리 상태의 생체에서는 free radical이 생성되고 free radical을 제거하는 항산화 방어체계(antioxidant defense system) 또한 존재하여 이들의 균형을 유지하고 있다. 그러나 여러 산화 스트레스로 인해 체내 free radical이 과다하게 생성되거나 항산화 효소의 활성을 감소시켜 세포에 상해를 일으키게 되고 여러 조직의 손상을 유발하여 질병의 원인이 되기도 한다. Free radical을 제거하여 생체를 보호하는 항산화 효소로는 superoxide (SOD), heme oxygenase(HO)-1, NQO1 등이 있고 비효소적 항산화계로 vitamin C, vitamin E, selenium 등이 있으며 이러한 항산화 방어체계는 산화적 스트레스로부터 조직을 보호한다(Perez 등, 2002). 따라서 새로운 항산화제의 개발을 통해 세포를 산화적 스트레스로부터 효과적으로 보호하고자 하는 연구가 꾸준히 진행되고 있다. 이 중 NQO1은 quinone 화합물을 환원시키는 과정에서 활성산소에 의한 세포 독성을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 특히, Nrf2의 유도에 의한 NQO1과 HO-1의 과발현이 염증매개물질인 iNOS와 COX-2의 발현을 억제함을 보여주었다(Yang 등, 2016). 본 연구에서도 GTEE의 처리에 의해 NQO1과 전사인자인 Nrf-2의 활성 유의적으로 유도가 되는 것을 확인하였다. 

결론적으로 GTEE는 NF-κB와 AP-1과 같은 염증성 전사인자의 억제와 2상 효소 발현 유도를 통해 HGF-1 세포에서 LPS-PG의 자극에 의한 염증을 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었고, 이는 치주질환의 치료를 위한 항염증제 후보 물질로서 GTEE의 가능성을 제시하는 결과로 생각된다. 

V. 결 론

치주조직에 존재하는 주요한 세포의 한 형태인 치은섬유모세포는 LPS로부터 유래하는 염증성 자극에 반응하여 여러 염증매개물질을 분비한다. 본 연구에서는 치주염을 유발하는 원인균 중 하나인 P. gingivalis로부터 분리한 LPS를 이용하여 사람 치은섬유모세포인 HGF-1 세포에 염증을 유도한 후 GTEE의 항염증기능과 항산화기능을 분석하였다. 그 결과 LPS-PG에 의해 과발현된 iNOS와 COX-2는 GTEE의 처리에 의해 농도 의존적으로 발현이 억제되었고, 전사인자인 NF-κB와 AP-1의 인산화 또한 동일한 경향으로 발현이 억제되었다. 그리고 발현의 유도가 항염증 효과를 나타내는 것으로 알려진 2상 효소 중 하나인 NQO1과 이의 전사인자인 Nrf-2를 분석한 결과 GTEE의 처리에 의해 효소의 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 GTEE는 NF-κB와 AP-1의 인산화를 억제하고 NQO1 활성을 유도함으로써 HGF-1 세포에서 LPS-PG에 의해 유도된 염증을 억제하는 것으로 사료되고, GTEE는 치주염 억제에 효과적인 항염증 물질의 가능성이 있는 후보물질이 될 수 있을 것으로 생각한다.