Ⅰ. INTRODUCTION

전리방사선은 산업, 의학, 교육연구 등 다양한 분야에서 활용되고 있다. 방사선의 사용은 사회나 개인이 방사선으로 받을 수 있는 피해를 상쇄할 수 있는 본질적이고 피해 이상의 이익을 가져다주는 정당화를 통하여 적극적인 사용이 이루어지고 있다. 방사선의 활발한 사용에 따라 각국의 규제기관에서는 개인피폭선량의 한도를 설정하여 관리를 하고 있으나, 의료분야에서는 선량한도를 설정하면 의학적 진단 및 치료에 있어서 한계점이 발생함에 따라 선량한도를 설정하지 않고 있다.^[1,2]

방사선 진단 및 치료를 받는 환자는 과피폭에 의하여 생체 분자구조의 변형, 정상 조직의 발암 및 중추신경계의 손상을 야기하는데 노출되어있다. 이는 방사선피폭으로 형성된 자유라디칼이 인체 내 미치는 영향으로, 방사선방호제는 자유라디칼을 줄여줌으로써 환자의 피해를 최소화하는데 중요한 역할을 할 수 있다.^[2-6] 따라서 방사선방호제의 중요성이 제창되는 가운데 부작용이 많은 화학적 방호제가 아닌 아로니아, 블루베리와 같은 천연물을 활용한 방사선방호제의 연구가 부각되고 있다.^[7-10]

본 연구에 사용된 아보카도(Persea Americana Mill)는 Lauraceae과에 속하는 열대지방의 아메리카 원주민 과일이다.^[11] 아보카도는 Polyphenol, Flavonoids, Carotenoids, Tocopherols 등 여러 가지 식물성 화학물질을 포함하고 있는 것으로 보고되고 있다.^[12-14] 이러한 성분을 가진 아보카도는 민간요법으로 사용되어왔는데 과육, 씨, 껍질에서 항암, 항염증, 항균, 항산화 효과를 나타낼 뿐만 아니라 심혈관질환, 당뇨, 신경학적 항경련 효과를 나타내고 있는 것으로 보고되고 있다.^[15-21] 하지만, 광범위한 연구가 진행되었음에도 불구하고 항방사선에 관한 연구는 진행되지 않았다.

본 연구에서는 아보카도의 방사선방호제로서의 가능성을 알아보기 위하여 실험동물에게 아보카도를 사전에 섭취시켜 방사선 피폭에 따른 피폭의 저감 및 회복의 정도를 살펴보고자 한다.

Ⅱ. MATERIAL AND METHODS

1. 아보카도 껍질 추출물의 준비

본 연구에서의 아보카도는 지역 대형마트에서 구매하여 사용하였다. 선행연구에 따라 과육, 씨, 껍질 중에서 항산화 능력에 기여하는 Polyphenol과 Flavonoids의 함량이 가장 높은 껍질을 시료로 사용하였다.^[22] 분리한 껍질은 실온에서 5 일간 공기건조를 시킨 다음 오븐에서 70 ℃로 15 분간 건조시켰다. 건조된 껍질을 분쇄기로 분쇄하여 에탄올:물 80:20 용액에서 추출하였고, 추출액은 여과지(Whatman International Ltd., Maidstone, UK)로 여과하여 감압농축을 하였다. 그 후 회전증발기(R-205V, BUCHI, Flawil, Switzerland)를 통해 건조하여 획득한 시료를 사용하였다.^[23]

2. 실험동물

2.1 실험동물

실험동물과 관련된 모든 절차는 동물실험윤리위원회(Institutional on Animal Care and Use Ethics Committee)의 승인(승인번호 : 2019-0004)하에 수행되었다. 7주령의 수컷 Sprague-Dawley Rat(하나바이오, Gyeonggi-do, Korea) 52 마리를 사용하였으며, 사육 환경은 온도 21±2 ℃, 습도 55±5 %, 조명시간 12 시간/일 낮/밤 Cycle로 일정하게 유지하였다. 아보카도 껍질 추출물은 선행연구를 참조하여 200 mg/kg의 용량으로 매일 14일간 경구투여 하였으며, 종료 시 까지 표준사료와 탈이온수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.^[23,24]

2.2 실험군의 분류

1 주일 간 새로운 환경에서의 적응기를 마친 후 임의적으로 4 개의 군으로 분류하였다. 일반대조군(Normal Control Group, 이하 NC Group), 아보카도 껍질 추출물 투여군(Persea Americana Injected Group, 이하 PA Group), 방사선조사군(Irradiated Group, 이하 IR Group), 마지막으로 아보카도 껍질 추출물 투여 후 방사선조사군(이하 PA+IR Group)으로 분류하였으며, 각 군당 방사선조사 후 4 일, 21 일 차로 소분류를 하였다. 분류된 군에 각각 6 마리씩 분류하고, 방사선을 조사하는 군은 방사선조사에 의한 탈락을 고려하여 1 마리씩 추가하여 구성하였다.

Table 1. Design of the experimental animal.

NC : Normal Control

PA : Persea Americana peel extract 200 mg/kg

IR : Irradiation

PA+IR : Irradiation after Persea Americana peel extract 200 mg/kg

3. 방사선 조사

방사선 조사는 선형가속기(Agility, ELEKTA, Stockholm, Sweden)를 이용하였다. 깊이 1.5 cm에서 D_max 지점이 되도록 교정하여 6 MV X-선으로 7 Gy를 1 회 전신조사 하였다.^[25]

4. 표본 채취

혈액 및 장기는 방사선 조사 후 4 일, 21 일 간격으로 채취하였다. 2 % Isoflurane을 흡입마취제로 사용하여 마취시킨 후 복대정맥에서 혈액을 채취하였다. 장기조직은 간, 소장, 비장을 적출하여 PBS(Phosphate Buffer saline)으로 세척하였다. 간, 소장은 조직학적 관찰을 위하여 10 % 포르말린(Formalin)에 고정을 하였고, 비장은 비장지수를 분석하기 위하여 건조시켜 무게를 측정하였다. 비장지수는 (비장의 무게/체중) × 100 으로 계산하였다.

5. 혈구 성분의 분석

채취한 혈액은 EDTA Tube에 담아 Coulter mixer 에서 혼합하여 동물용 혈구분석기(BC-2800VET, Mindray, Shenzhen, China)를 이용하여 림프구, 적혈구 그리고 혈소판을 분석하였다.

6. SOD 활성 분석

방사선 피폭으로 인하여 발생하는 자유라디칼의 소거능을 확인하기 위하여 SOD(Superoxide Dismuta se) 활성도를 분석하였으며, SOD Assay kit - WST (Dojindo Mtolecular Technologies, Inc., Japan)을 사용하여 측정하였다. 시료는 4 ℃에서 600 g로 10 분간 원심분리하여 혈장을 사용하였으며, SOD 활성을 측정하기 위해서 시료를 Dilution buffer로 1, 1/5, 1/5², 1/5³, 1/5⁴, 1/5⁵, 1/5⁶의 비율로 희석하였다. 준비된 시료를 판매사에서 제공하는 매뉴얼로 96-wel 1 microplate에 분주하고 Spectrophotometer(PowerWave XS2, BioTek, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 SOD activity를 계산하였다.

7. 조직학적 분석

적출된 조직은 10 % 포르말린(Formalin)으로 고정한 후 일반적인 파라핀 절편법(Paraffin method)에 따라 파라핀 블록(Paraffin block)을 제작하였다. 그 후 4 μm 로 박절하여 H&E staining 하였다.

간은 방사선피폭에 의한 간세포의 괴사 및 침윤된 염증세포를 관찰하였고,^[26] 소장은 소장움세포의 장해로 인해 발생하는 융모길이의 차이를 관찰하여 각 군간 비교분석하였다.^[27]

8. 통계학적 분석

실험결과의 통계는 SPSS 26(IBM, USA)을 이용하였다. T-test를 통한 평균 및 표준편차 (Mean±S.D)로 분석하였으며, p<0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

Ⅲ. RESULT

1. 혈구성분의 변화

방사선 조사 후 21 일이 경과하였을 때 림프구, 적혈구, 혈소판에서 IR Group에 비하여 PA+IR Group에서 회복의 정도가 빠른 유의한 효과를 나타내었다. 림프구에서 IR Group은 3.26±0.85 10³/μl로 나타났으며 PA+IR Group에서는 5.2±1.05 10³/μl로 유의한 회복을 나타냈다.(p<0.01) 적혈구에서 IR Group은 5.37±0.04 10³/μl로 나타났으며 IR+PA Group에서는 5.91±0.11 10³/μl으로 유의한 회복이 나타났다.(p<0.01) 마지막으로 혈소판에서는 IR Group은 976.5±224.15 10³/μl로 나타났으며 IR+PA Group에서는 1249.83±63.07 10³/μl으로 유의한 회복이 나타났다.(p<0.05), (Fig. 1).

Fig. 1. Change of Blood Corpuscle in Rat at 21 days after 7 Gy irradiation. *p<0.05, **p<0.01, significance level compared to each other.

2. SOD 활성 변화

방사선 조사 후 4 일이 경과하였을 때 혈장의Superoxide 음이온의 환원반응을 억제하는 희석비율은 IR Group보다 PA+IR Group에서 더욱 높게 나타났다.(Fig. 2) 이는 SOD 활성도를 평가했을 때 방사선조사군은 NC Group 만큼의 SOD 활성을 나타내지는 못하였으나, 방사선조사군 간 비교하였을 때 PA+IR Group은 171.18 U/ml의 값으로 IR Group 114.48 U/ml보다 더 높은 SOD 활성을 나타내었다.(p<0.05), (Table 2)

Fig. 2. Inhibition curve of blood for analysis SOD activity.

Table 2. Changed of SOD activity of blood at 4 days after 7 Gy irradiation.

3. 비장 지수 변화

방사선조사 후 21 일이 경과되었을 때 비장의 지수는 IR Group에 비하여 PA+IR Group에서 회복의 정도가 빠른 유의한 효과를 나타내었다.(p<0.05), (Fig. 3)

Fig. 3. Changed Spleen Index at 21 days after 7 Gy irradiation. *p<0.05.

4. 조직학적 관찰

4.1 간의 조직학적 관찰

방사선조사 후 21 일이 경과되었을 때 NC Group과 PA Group에서는 핵, 핵막 및 세포질 등 대부분의 주요세포들이 규칙적인 정상배열을 유지하고 있었다. 방사선이 조사된 IR Group과 PA+IR Group에서는 간 손상을 의미하는 세포질의 팽창과 염증세포가 침윤되는 염증반응이 관찰되었다. 두 그룹 간의 비교를 통해 PA+IR Group에서 핵의 응집, 세포질의 팽창 등이 소폭 감소된 것이 관찰되었다. 이는 Fig. 4와 같다.

Fig. 4. Photomicrographs of the rat’s liver on H&E stained by optical. (A) NC; (B) PA; (C) IR; (D) PA+IR

4.2 소장의 조직학적 관찰

방사선으로 피폭되면 감수성이 높은 소장(소장움)의 융모길이에서 반응이 확연히 드러난다. 방사선조사 후 21 일이 경과되었을 때 IR Group은 소장움 세포의 사멸로 융모길이가 424.48±18.29 μm로 NC Group의 융모길이 711.51±16.25 μm에 비하여 매우 짧아졌다. 반면에 PA+IR Group은 595.23±16.3 μm로 IR Group에 비교하였을 때 피해가 유의하게 감소한 것으로 나타났다.(p<0.01), (Fig. 5)

Fig. 5. Photomicrographs of rat’s small intestine(villi length) on H&E stained by optical. (A) NC; (B) PA; (C) IR; (D) PA+IR

Ⅳ. DISCUSSION

인체는 방사선으로부터 피폭이 발생하면 주로 자유라디칼에 의한 세포손상 메커니즘을 진행하게 된다. 따라서 자유라디칼을 소거할 수 있는 물질을 이용한 방사선방호제 개발은 중요한 연구과제로 볼 수 있다.^[28,29] 본 연구는 Polyphenol, Flavonoids, Carotenoids, Tocopherols과 같이 자유라디칼 소거 기능을 하는 것으로 알려진 식물성 화학물질을 함유하고 있는 아보카도 껍질추출물을 이용하여 방사선 방호효과를 탐색하였다.

방사선 피폭에 대한 아보카도의 방사선 방호효과를 탐색하기 위하여 아보카도 껍질 추출물을 Sprague-Dawley Rat에 경구투여 한 후 7 Gy의 6 MV X-ray를 전신조사 하였다. 방사선조사를 받은 IR Group과 PA+IR Group의 혈구성분은 PA+IR Group의 림프구(p<0.01), 적혈구(p<0.01), 혈소판(p<0.05)에서 유의하게 회복하는 결과가 나타났다. 그리고 SOD 활성도 측정에서 WST-1과 Superoxide 음이온의 환원반응을 억제하는 샘플 용액 20 μl의 효소의 양을 SOD의 단위로 정의하였으며, WST-1의 환원반응에 대한 IC50으로 측정하였다.^[30]

SOD 활성은 PA+IR Group(171.18 U/ml)이 IR Group(114.48 U/ml)보다 더 높은 활성도를 나타냄으로써 방사선 피폭으로 인하여 발생한 자유라디칼을 아보카도가 소거하는 것을 확인하였다.

방사선이 전신에 조사되면 비장은 민감한 조혈기관으로서 림프구의 괴사, 염증반응 등에 의해 중량이 감소하는 경향이 있다.^[31] 방사선 조사 후 21 일이 경과되었을 때 비장 지수는 PA+IR Group이 0.198±0.02 %로 IR Group 0.167±0.02 % 보다 유의하게 높게 나타나 방사선에 대한 방호효과를 확인하였다.(p<0.05)

또한, 본 연구를 통하여 방사선이 간과 소장움 세포에 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 간은 방사선의 영향으로 IR Group과 PA+IR Group에서 중심정맥을 중심으로 세포막이 분리되어 불규칙적인 모양과 세포가 침윤되는 염증반응 및 핵의 응집과 같은 괴사가 관찰되었다.^[26,32] 하지만 PA+IR Group에서 IR Group보다 세포막의 분리, 세포 침윤현상, 응집된 핵의 수가 다소 감소하여 아보카도가 방사선 피폭에 의한 간 손상을 줄이는 효과를 확인하였다. 그리고 소장의 융모를 형성하는 소장움 세포는 방사선에 감수성이 높은 것으로 알려져 있다.^[27] 본 연구에서 PA+IR Group의 융모길이는 IR Group의 융모길이보다 길게 관찰됨으로써 방사선에 의한 길이 감소가 완화된 것을 관찰하였다. 이는 아보카도 껍질추출물이 항산화 역할을 수행함으로써 방사선 방호기작에 의한 결과로 분석된다.

Ⅴ. CONCLUSION

아보카도 껍질추출물의 방사선 방호효과를 확인하고자 7 Gy의 6 MV X-ray를 실험동물에 조사하여 실험군을 모델링하였다. 아보카도 껍질추출물 섭취 후 방사선조사를 받은 군은 방사선 조사만 받은 군에 비하여 혈구 성분과 비장 지수의 감소가 완화되고 SOD가 활성화되는 것을 확인하였다. 조직학적 관찰에서는 간 손상의 감소, 소장움세포의 피해가 완화되는 것을 확인하였다.

본 연구는 아보카도의 껍질 내 구성성분이 방사선 피폭에 따른 방호기작에 기여하는 것을 확인한 것으로, 아보카도의 세부 주요물질을 다루지 못한 한계점이 존재한다.