Ⅰ. INTRODUCTION

방사선은 다양한 곳에서 사용한다. 감마선이 방출되는 방사성동위원소는 방사선비파괴검사에서 많이 쓰이고 있다. 방사선비파괴검사를 통해 용접시의 결함을 확인하지 않거나 그에 합당한 절차를 진행하지 않는다면 부실공사로 인해 과거 삼풍백화점 붕괴 사고나 성수대교 붕괴 사고처럼 대규모 인명피해가 일어날 우려가 있다.^[1-3] 이러한 건축물의 결함평가 중 방사선비파괴검사는 필수과정이지만 방사선비파괴검사를 진행하는 작업종사자는 방사선을 이용함으로써 피해를 받고 있다.^[4] 약 10년 전인 2011년과 2012년에 울산의 비파괴업체에서 감마선이 방출되는 이리듐(Ir)을 사용하여 방사선비파괴검사를 진행했다. 이에 종사한 방사선비파괴검사원은 과도한 피폭으로 인해 백혈병과 골수이형증후군으로 사망하였다.^[5]

이처럼 방사선 사용은 방사선 장해를 유발한다. 국제방사선방호위원회(International Commission on Radiological Protection)의 권고사항 ICRP60에 의하면 방사선의 지속적인 피폭으로 인해 유전적 결함, 백혈병, 암의 발생 확률이 증가한다고 명시되어 있다.^[6]

방사선이 인간에 미치는 영향을 줄이기 위한 방법은 방호제가 있다. 방호제는 방사선 피폭사고나 암 치료에 이용되는 고방사선의 부작용을 줄이는 의약품이다. 화학적 방호제가 주를 이루고 있으나 화학적 방호제 또한 독성을 가지고 있어 복용 시 구토나 설사 등을 유발하는 단점 갖고 있다.^[7] 따라서 화학적 방호제 복용 시 일어나는 구토나 설사 등을 방지하기 위한 천연방사선방호제가 활발히 연구되고 있는 실정이다. 천연 방사선 방호제로써 역할을 하고 있는 물질은 질경이, 흑마늘, 민들레, 백 하수오 등이 있다.^[8-11]

타히보(Tabubuia avellanedae)는 항산화물질 중 하나이다. 남미 아마존 강 유역 특정지역에서 생육하는 Tabebuia avellanedae의 약 7~10 mm에 존재하는 내부수피를 추출한 것으로 퀴노이드(Quinoid), 벤제노이드(Benzenoid), 플라보노이드(Flavonoid), 라파콘 (Lapachone)을 많이 함유하고 있어 항암, 항산화 효과가 있다고 밝혀진 바 있다.^[12] 이무홍^[13]의 연구에 의하면 타히보에 함유되어 있는 아르키돈산(Arachidonic acid)은 Cox산물 생성을 억제하며, 나프토퀴논(1,4-naphthopuinone)의 함유로 살균능력이 탁월하다는 연구결과가 존재한다.

타히보가 폴리페놀(Polyphenol)을 함유하고 있어 활성산소(Free radical)를 생성 억제하는 효과가 있다는 연구결과도 존재한다. B.MUKHERJEE^[14]의 연구에 의하면 유방암세포라인(ER+ MFC-7 Cells Line)에 타히보 추출물의 농도에 따른 세포성장률을 억제했다는 연구결과가 있다. 타히보 추출물에 함유된 라파콘(Lapachone)은 간기 세포 라인의 진행과 전이성을 억제하며, 전립선암의 세포라인인 Du 145 Cells를 대상으로 세포성장을 억제한다. 또 베타라파콘(β-Lapachone)이 폐암 세포에서 텔로머레이즈 활동과 hTERT활동을 억제한다는 연구결과가 보고되고 있다.

본 연구는 보고 되어 있는 타히보 추출물의 전립선 암에 대한 항암효과를 기본 바탕으로 하여 SD Rat(Sprague-Dawley Rat)에 방사선을 조사한 후 일어나는 신체적 부작용 저감 및 회복능력을 연구하여 타히보 추출물의 천연 방사선 방호제로써 방사선 방호효과을 확인하고자 한다.

Ⅱ. MATERIAL AND METHODS

1. 타히보 추출물 제조

연구에 사용된 타히보는 ㈜신영허브(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 분말 가루 형태이며, 직사광선 및 습기조절을 위해 5 ℃에서 냉장보관 하였다. 타히보 분말 10 g과 증류수 700 mL를 혼합하여 끓기 시작한 시점으로부터 6 시간 동안 추출하였다. 이후 Vertical Autoclave(Gongju-si, Korea)을 이용하여 2 시간 고온멸균 하였다.

2. 실험동물 관리 및 사육

실험동물은 수컷 SD Rat 5 주령을 사용하였다. 환경은 온도 21±2 ℃, 습도 55±5 %, 조명 12 hour/day 로 조성하였다. 1 주간의 순응기간을 거쳤 으며, 실험군 편성은 대조군(Control), 방사선조사군 (IR), 타히보 투여군(TH), 타히보 투여 후 방사선 조사군(IR+TH)으로 나누어 실험하였다. 타히보군과 타히보 투여 후 방사선 조사군은 2 cc/kg/day의 용량을 존대를 이용하여 14 일간 경구투여 하였다.(Table. 1).

Table. 1. Composition of experimental groups.

Control : Normal Control

TH : Taheebo was orally

IR : Irradiation

IR+TH : Taheebo was orally and Irradiaion

3. 방사선조사

방사선조사는 ICRP60(International Commission on Radiological Protection)의 권고사항^[15]에는 인간에게 일어나는 결정적 영향 중 전치사선량은 7 Gy이다. 그러나 베르고니-트리본도 법칙에 의하면 하등동물에게는 그 효과가 반감되어 나타난다. 따라서 선형가 속기(Elekta Linac, Sweden)로 Field Size 35 X 35 cm²으로 고정하고, 실험동물을 특수 제작된 30 X 30 cm²아크릴용기에 넣은 다음 심부선량 10 mm 지점에서 100% 선량이 되도록 7 Gy X-선을 조사하였다.

Fig 1. linear accelerator Used in SD Rat irradiation.

4. 혈액학적 관찰

채취혈액은 방사선 조사 후 1 일, 7 일, 21 일 차 SD Rat을 통해 얻었다. 채취 후 동물용 EDTA 0.5 cc Tube에 보관 후 즉시 Coulter mixter를 이용하여 응고를 방지하였다. 방사선 작업 종사자의 건강진단기준에 포함되는 백혈구, 적혈구 등을 분석하였다. 신뢰도를 위해 각 군의 개체 당 3 회의 혈액검사를 시행하여 총 횟수의 평균값을 구했다.

5. 외부독성평가

H.SAITO 등의 기법^[16]을 응용하여 타히보 추출물의 인체 외부적 독성평가를 위해 LDH(Lactate dheydrogenase) assay를 수행하였다. LDH assay는 세포가 스트레스, 부상, 화학물질 또는 세포 간 신호에 의해 손상되면, 세포막에서 LDH가 빠르게 방출된다. 그러므로 방출된 LDH의 양을 측정하는 것은 세포사멸을 평가하는 중요한 방법이다.^[17-21] 본 연구에서는 HEK 293 T 세포를 사용하였으며, 96 well plate의 각 well당 15,000 cell을 배양하였다. 각 well을 분리하여 타히보 추출물 투여군, Lysis Buffer를 첨가한 High Control군과 Control군으로 편성하였다. 편성 후 CO₂ incubator에서 배양하였고, 배양 후 30 분간 실온에서 반응시켰다. 다음 ELISA reader(biotek, USA))를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

\(\text { Cytotocivy(%) }=\frac{(A-C)}{(B-C)} \times 100\)         (1)

A : Test substance

B : High control

C : Low control

6. SOD assay

Marklund 등^[22]기법을 응용하여 SOD(superoxide dismutase)의 활성화를 관찰하였다. 혈액 채취는 10주령 실험동물 SD Rat의 정맥을 통해 채취하였다. 채취한 혈액은 헤파린 1000 U 0.05 mL와 혼합하여 차광 후 4 ℃에서 600 g로 10 분간 원심분리 하였다. 혈청과 혈구가 분리된 시료를 혈청을 제거하고 식염수와 혈구시료 1:1 비율로 희석하였다. Pipette를 이용하여 섞은 후 다시 4 ℃에서 600 g로 10 분 간 원심분리 하였다. 같은 과정을 2 번 더 반복한 후 혈구시료에 증류수 4 mL, 에탄올 1 mL, 클로로 포름 0.6 mL를 첨가하여 혼합하였다. 4 ℃에서 Shaker를 이용해 혼합물을 15 분간 교반한 후 4 ℃ 에서 600 g로 10 분간 원심분리하고 혈장을 걷어 새로운 Conical Tube에 담아 옮겼다. 그 후 1.5 mL 튜브에 옮긴 시료 0.1 mL와 증류수 0.7 mL, 0.25% 에탄올 0.7 mL를 혼합하여 농도 1의 시료를 제조하였다. 농도 1 시료를 희석하여 1/5, 1/5², 1/5³, 1/5⁴, 1/5⁵, 1/5⁶ SOD Sample시료를 제조하였다. 다음 96 well plate에 각 농도별 시료를 20 uL씩 넣고, Dilution butter 20 uL, WST 200 uL를 넣었다. Sample well과 BLANK1 well에는 Enzyme Solution 20 uL를 첨가 후 incubator에서 반응 후 micro plate reader를 이용해 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

\(\begin{array}{l} \text { SOD activity(%) } =\frac{[(\text { Ablank1-Ablank2 })-(A \text { sample }-A \text { blank } 2)]}{(A b l a n k 1-A b l a n k3)} X 100 \end{array}\)        (2)

7. 조직학적 관찰

관찰 대상인 전립선은 방사선 조사 후 1 일, 21일 차 SD rat을 통해 얻었다. 채취한 조직은 10 % Formalin을 제조하여 보관하였다. 다음 70 % Ethanol로 조직을 탈수한 후 Xylene으로 치환하여 Paraffin block을 제작하였다. 제작한 Paraffin block 을 슬라이드로 분할하여 H&E staining하여 광학 현미경으로 관찰하였다.

8. 통계 처리 및 분석

실험결과는 IBM SPSS statistics version 26 통계 프로그램을 이용하여 T-test 분석하였다.

Ⅲ. RESULT

1. 혈액학적 관찰

방사선 조사 후 1 일, 7 일, 21 일차 림프구의 수치가 회복되는 것을 확인할 수 있다. 데이터를 토대로 IR Group의 회복 능력보다 IR+TH Group의 회복 능력이 더 큰 상승폭을 나타냈다.(p<0.01)(Fig. 2)

Fig. 2 Recovery rate of lymphocytes after X-ray 7 Gy irradiation.

적혈구 수치는 방사선조사 후 21 일 차 IR Group에 대해서 IR+TH Group이 더 적은 감소폭을 보였다.(p<0.05)(Fig. 3)

Fig. 3 A fter X - ray 7 Gy i rradiation, t he r ate of reduction of red blood cells.

2. 외부독성평가

LDH assay를 수행하였으며, 타히보 추출물 독성은 가장 높은 수치는 18.129±5.16 %로 나타났다. 가장 낮은 수치는 13.6945±4.43 %로 나타났다.

3. SOD assay

선형가속기를 이용해 X-선 7 Gy를 조사한 날로부터 21 일 후의 혈액 속 SOD 활성도를 측정하였다. 각 군별 혈액 내 SOD활성도는 방사선을 조사한 개체들의 수치가 대조군에 비해 현저히 낮게 나타났다. IR Group과 IR+TH Group의 SOD 활성도는 대조군에 비해 각각 0.06 %, 14.5 %로 나타났다. IR군과 IR+TH군을 비교·분석 결과 IR+TH군의 SOD 활성도가 약간 더 높은 활성을 나타냈다.

Table. 2. Superoxide dismutase active change in blood 21 days after X-ray 7 Gy irradiation (Unit : U/ml)

4. 조직학적 관찰

Control Group(Fig.3.A), TH Group(Fig.3.B)의 전립선은 세포핵의 응집이나 염증반응이 나타나지 않았다. 세포핵 및 세포질이 균질하게 구성되어 있다. 이에 비해 IR Group의 전립선(Fig.3.C)은 세포질이 파괴되는 경향을 보인다. IR+TH Group(Fig.3.D)은 IR Group에 비해 세포핵과 세포질의 형태가 균질하게 나타났다. 그러나 Control Group에 비해 세포핵, 세포질의 구성이 균질하지 않게 나타났다.(Fig. 3)

Fig. 3. Observation prostate of SD Rat by H&E staining after X-ray 7 Gy irradiation.

Ⅳ. DISCUSSION

방사선을 사용한 기술은 우리 현대인들의 생활에서 흔히 볼 수 있다. 가장 들기 쉬운 예로 건축공사나 교량건설 또는 대형 선박제조 작업에 사용되는 방사선비파괴검사가 대표적이다. 용접 부위 내 결함을 판독할 때 방사선비파괴검사가 주로 쓰인다. 방사선비파괴검사는 감마선을 내는 방사성동위원소인 ¹⁹²Ir, ⁷⁵Se, ⁶⁰Co 등을 사용한다. 방사선이 물을 피폭하면 물은 방사분해가 일어나 1차 Free radical을 생성한다. 인체의 구성성분 중 70 %는 물로 되어 있다. 그러므로 인체 또한 방사선 피폭 시 생성된 Free radiacl로 인해 부작용이 나타난다. ICRP60 권고사항에 따르면 지속적인 방사선 피폭은 유전적 결함, 백혈병, 암을 유발할 수 있다고 명시되어 있다.^[6] 따라서 방사선 피폭에 의한 부작용을 예방할 수 있는 천연 방사선 방호제의 연구가 필요하다.

타히보는 천연물질에 포함된다. 퀴노이드(Quinoid), 벤제노이드(Benzenoid), 플라보노이드(Flavonoid), 라파콘(Lapachone)을 많이 함유하고 있어 항산화효과가 존재한다고 보고 되었다.^[12] 특히 라파콘(Lapachone)은 전립선 암세포 DU 145 Cells의 세포 성장을 억제하는 역할을 한다.^[14]

본 연구는 타히보의 전립선에 대한 항산화효과와 천연 방사선 방호제로서의 능력을 확인하고자 실험하였다.

혈액학적 실험으로 보아 IR Group, IR+TH Group 의 방사선 조사 1일 차 림프구의 수는 Control Group의 림프구 수에 비해 현저히 낮게 나타났다. 혈액 속 유일하게 핵을 가진 성분인 림프구는 방사선 조사에 의해 손상 되어 가장 낮은 수치를 나타낸 것으로 사료된다. 그러나 방사선 조사 후 7 일, 21 일 차의 IR Group과 IR+TH Group의 림프구의수가 점차 증가되는 것이 관찰되었다. 이것은 ICRP60에 명시된 결정적 영향인 방사선 피폭에 일어나는 혈구성분과 같은 변화이다. 타히보가 방사선 피폭 시 림프구의 감소에 대한 방호효과는 미미한 것으로 보인다. 하지만 IR Group과 IR+TH Group을 비교하였을 때 IR+TH Group의 림프구 수치가 IR Group보다 높은 것으로 보아 타히보 추출물이 조혈면역계의 회복능력에 효과가 있는 것으로 사료된다.

인체 외부적 세포독성평가는 LDH assay를 수행하였다. LDH(Lactate dehydrogenase)로 세포막 내에 존재하는 세포형태의 효소이다. LDH는 세포자연사(apoptosis)가 아닌 주로 스트레스, 부상, 화학 물질 또는 세포 간 신호에 의해 손상되면 세포막으로부터 방출된다. 이를 외부자극사(necrosis)라 한다. LDH assay는 외부자극사에 의해 방출되는 LDH의 양을 측정하는 것으로 세포의 독성을 평가하는 방법 중 하나이다.^[17-21]

평가는 CRCERT(The Cooperative Research Centre For Eye Research and Technology)의 세포 독성 염색 법을 사용한 독성 평가 보고서를 기준으로 하여 평가하였다.^[23] 타히보 추출물 독성은 가장 높은 수치는 18.129±5.16 %로 나타났다. 가장 낮은 수치는 13.6945±4.16 %로 나타났다. CRCERT의 독성 평가 기준은 30 % 이상이면 독성이 존재하는 것으로 판정하므로 타히보 추출물의 독성은 미미한 것으로 사료된다.

수많은 항산화 효소 중 하나인 supoeroixde dismutase(SOD)는 superoxide anion(O_2^-)을 과산화수소(H₂O₂)로 변환시킨다. 이때 형성된 과산화수소는 카탈라아제(catalase)로 인해 물과 산소로 분해되고 세포내 자유라디칼(Free radical)을 제거한다. 그러므로 SOD의 활성화는 방사선 조사에 의해 생성된 자유라디칼을 제거하는 항산화 효과로써 방사선 방호에 대해 중요한 영향을 미친다. 각 군별 혈액내 SOD활성도는 방사선을 조사한 개체들의 수치가 대조군에 비해 현저히 낮게 나타났다. 방사선 조사군(IR)과 타히보 투여 후 방사선 조사군 (IR+TH)의 SOD 활성도는 대조군에 비해 각각 0.06%, 14.5 %로 나타났다. IR Group과 IR+TH Group 을 비교·분석 결과 IR+TH Group의 SOD 활성도가 약간 더 높은 활성을 나타냈다. 다른 천연 방사성물질을 이용한 선행연구와 비슷한 SOD활성 경향을 나타냈다. 이는 타히보 추출물이 천연 방사선 방호제로써 역할을 수행할 수 있음으로 판단된다.

전립선은 수컷의 생식선 중 하나이며 기능은 전립선액을 정소에서 분비하여 정자에게 영양을 공급하고, 정자가 활발하게 운동할 수 있도록 한다. 방사선 조사 후 21 일 차의 전립선은 Control Group(Fig3. A.)과 TH Group(Fig 3. B.)의 세포핵의 응집이나 세포질 내의 염증반응이 나타나지 않았다. 그러나 IR Group(Fig 3. C.)은 세포사멸이 관찰되었다. 이에 비해 IR+TH Group(Fig 3. D.)은 IR Group과는 다르게 세포질 내의 염증반응이나 세포 핵의 응집현상은 나타나지 않았다. IR Group 처럼 세포사멸과 같은 반응이이 나타난다면 전립선염이나 전립선비대증으로 성장·확대될 수 있다고 판단된다. IR Group에 비해 IR+TH Group의 세포핵 및 세포질이 균질한 것으로 보아 타히보 추출물은 방사선 조사에 의한 방사선방호효과가 있는 것으로 사료된다.

Ⅴ . CONCLUSION

혈액학적 분석 중 백혈구, 적혈구의 수치는 방사선작업종사자 건강진단기준에 포함된다. 방사선 조사 후 21 일차 IR+TH군의 적혈구, 백혈구 각각의 수치는 4.01 10³/μL, 5.025 10³/μL이다. IR군 적혈구, 백혈구 각각의 수치는 3.295 10³/μL, 2.65 10³/μL를 나타냈다. 이는 IR+TH군은 IR군에 비해 적혈구, 백혈구 회복 능력이 뛰어난 경향을 나타냈다.

SOD활성도는 IR군은 대조군에 비해 0.06 %를 나타내었고, IR+TH군은 대조군에 비해 14.5 %를 나타냈다. IR+TH군이 IR군에 비해 SOD활성도가 더 높게 나타나는 경향을 보였다.

이러한 경향은 항산화 물질인 타히보가 방사선 조사에 의해 생성되는 Free Radical을 제거하는 기전을 보인 것으로 판단된다. 또한 타히보의 수많은 화학기질들의 체내작용에 대한 연구가 필요하다.

따라서 타히보는 방사선 방호 효과가 있다는 것을 확인하였다. 이는 천연 방사선 방호제 개발에 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다. 또 비파괴검사원 뿐이 아니라 방사선작업종사자들이 타히보를 섭취한다면 부작용을 예방할 수 있을 것으로 기대된다.