서 론

1990년대 초반부터 넙치의 수요가 급격하게 증가함에 따라 넙치양식 산업 또한 발전하고 있다[19]. 하지만 고밀도 사육으로 인한 어류의 스트레스와 수질저하 등 여러 요인으로 폐사량이 급격히 증가되고 있다. 이로 인해 생산량이 점차 감소하여 경제적으로 큰 손실을 초래하게 된다.

넙치 폐사의 주요 원인으로 세균성 질병, 기생충성 질병, 바이러스성 질병이 있다. 그 중 세균성 질병이 넙치의 많은 폐사를 유발하며 원인균으로는 Streptococcus parauberis, Streptococcus iniae, Edwardsiella tarda, Vibrio anguillarum로 알려져있다[15]. 치료방법으로 항생제 투여 및 백신과 같은 화학적 요법을 사용하게 된다[14]. 하지만 항생제의 무분별한 사용으로 어체 내 항생제의 잔존량이 높아지고 내성균주가 등장하는 등 여러 부작용을 일으킨다[6].

이러한 문제점을 해결하기 위해 새로운 메커니즘을 갖는 천연항생물질이 주목 받고 있다. 하지만 1980년 이후 육상의 미생물로부터 분리된 항생물질의 관한 연구는 꾸준히 감소하고 있는 실정이다[1]. 따라서 육상과는 환경이 다른 해양미생물이 큰 관심을 받고 있다[13]. 해양미생물의 다양성과 대사산물에 대한 연구는 아직 미비하기 때문에 새로운 항균물질작용을 기대할 수 있다.

Paenibacillus sp. 균들은 다양한 환경에서 분리되어지며 항균활성물질을 생산한다고 보고되어지고 있다. 또한 광범위한 항미생물 효과가 알려져 있으며 많은 연구가 진행되고 있다 [21].

이번 연구에서는 해수로부터 Paenibacillus sp. 균을 분리하였고 어류질병세균에 대한 항균활성을 평가하였다. 그리고 분리된 Paenibacillus sp.의 염기서열 분석과 형태학적 및 생화학적 테스트를 수행하였고 최적 배양조건을 탐색하였으며 해양유래 Paenibacillus sp.의 새로운 항균물질의 개발 가능성을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

해양유래 미생물 분리 및 보관

시료는 제주특별자치도 서귀포시 대정읍 인근 연안의 해수를 멸균된 채수병에 채취하여 4℃에 보관 운송 하였다. 채취된 시료는 멸균된 0.85% 생리식염수에 1 ml를 넣고 10−1~10−4배로 희석하여 Marine Agar, Brain Heart Infusion Agar, Tryptic Soy Agar (MA, BHIA, TSA, Difco, USA)에 도말 하여 25℃에서 7일간 배양하였다. 배지 상에서 나타나는 균의 형태학적 모습을 관찰하여 분리하였으며 분리된 균주는 24% (v/v) glycerol에 현탁하여 −85℃에 보관 하였다.

어류 질병 세균에 대한 항균활성 탐색

분리된 균주에서 어류 질병 세균에 대한 항균활성을 탐색하기 위해 Disc Diffusion method를 이용하여 실험을 수행하였다. 실험에 사용된 어류 질병 세균은 그람양성 2종(Gram-positive: Streptococcus iniae KCTC 3757, Streptococcus parauberis KCTC 3651), 그람음성2종(Gram-negative: Vibrio anguillarum KCTC 2711, Edwardsiella tarda KCTC 12267)으로 생물자원센터 KCTC (Korean Collection for Type Culture)로 부터 분양 받았다. 분양 받은 병원균은 Brain Heart Infusion Broth (BHIB, Difco, USA)에 접종하여 25℃에서 24시간 배양하였다. 배양액을 0.85% 생리식염수로 희석하여 0.5 McFaland 탁도로 맞춘 뒤 멸균된 면봉으로 Mueller Hinton Agar (MHA, Difco, USA)에 도말 하였다. 분리된 14균주를 Marine Broth (MB, Difco, USA)에 배양한 후, 원심분리기(Micro 17TR, Hanil, Korea)를 사용하여 4,745x g, 15 min간 원심하였고 분리한 상층액을 8 mm paper disc에 50 μl를 적하하여 건조 시켰다. 그 뒤 어류질병균이 도말된 MHA에 일정간격으로 올려놓고 25℃에서 24시간 배양 후 형성된 억제존(Clear zone)의 지름 (mm)을 측정하였다. 또한 이전 연구결과[8, 20]에서 S. iniae에 대한 항균활성이 높은 균주를 분양 받아 비교실험을 하였다.

양식장에서 주로 사용하는 항생제 5종(Neomycin, Gentamicin, Tetracycline, Oxytetracycline, Erythromycin) (Sensi- Disc, BBL, USA)을 사용하여 S. iniae에 대한 항생제 감수성 테스트를 수행하였다.

최소억제농도 측정

S. iniae에 대한 최소억제농도를 확립하기 위하여 항균활성이 가장 높은 균주의 배양액을 14,240× g, 10분간 원심분리하였다. 분리된 상층액을 여과한 후 농축기(HS-2001N, HAHN SHIN, Korea)를 사용하여 농축하고 동결건조를 한 뒤 3차 멸균 증류수로 단계희석 하여 농도별로 적하 하였다. 24시간 배양 후 분광광도계(GB/Libra S22, Biochrom, USA)를 사용하여 660 nm에서 Optical density (O.D)값을 측정하였다.

형태학적 및 생화학적 동정

어류질병세균에 대하여 가장 뛰어난 항균활성을 보여 선발된 균주의 형태학적 동정을 위해 scanning electron microscope (JSM-6700F, JEOL Ltd., Japan) 촬영 및 그람 염색을 수행하였으며, casein, starch, nitrate 환원 실험, catalase, urease 가수분해 실험, oxidase test, hemolytic, Tween 40, 80, indole생성능, Voges-proskauer test, Methyl Red test, Citrate utillzation test 및 API 50 CHB Kit (BIOMERIEUX, USA)를 사용하여 생화학적 동정 및 당 이용능을 조사하였다.

최적배양조건 탐색

선발된 균주의 최적생육조건을 알아보기 위해 온도, NaCl, pH를 각각 설정하여 실험을 수행하였다. 배양 온도는 15~40℃(5℃ 간격), NaCl 농도 1~5%, pH는 2.0~9.0 범위로 각각 설정하여 Tryptic Soy Broth (TSB, Difco, USA)배지를 제조하였다. 제조한 배지에 균주를 접종 후 24시간 동안 배양하여 660 nm에서 생육도를 측정하였다. 선발 균주의 최적 배지성분의 검토는 GY배지(glucose 0.5%, yeast extract 0.1%, MgSO4·7H2O 0.02%)를 사용하였다[6]. 탄소원은 glucose, sobitol, mannose, soluble starch, lactose, fructose, sucrose, 질소원은 yeast extract, malt extract, peptone, NaNO3, (NH4)2SO4, 무기염은 NaCl, MgSO4·7H2O, CuSO4·5H2O, K2HPO4, FeSO4·7H2O를 각각 1%씩 첨가하여 25℃에서 24시간 배양한후 660 nm에서 생육도를 측정하였다.

분자생물학적 동정(16S rDNA계통분석)

선발된 균주의 DNA는 Genomic DNA Extraction kit (Bioneer, USA)를 사용하여 추출하였다. 균주의 16S rDNA유전자 증폭을 위해 primer는 27 Forward primer와 1492 Reverse primer를 사용하였다. PCR 조건은 95℃에서 초기 변성단계 5분, 94℃에서 변성단계 1분, 55℃에서 결합단계 1분, 72℃에서 합성단계 1분으로 총 30 cycle, 최종 합성단계로 72℃에서 5분 PCR (US/MYGein32, MJ RESEARCH, USA)을 실시하였다. 증폭된 16S rDNA는 ㈜솔젠트(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석 하였다. 분석된 염기서열은 미국 국립생물정보센터인 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) search program에서 Genbank database와 Ez Taxon-e (http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)의 database를 이용하여 유사한 염기서열을 비교하였으며 가장 근연속 또는 종으로 나타나는 서열을 확인하였다. 결정된 염기서열과 database에서 확인한 표준 미생물 염기서열을 ClustalW software로 multiple alignment를 수행하고 Mega 5.0 software 프로그램을 이용하여 phylogenetic tree를 작성하였다.

결 과

해양유래 미생물 분리

채집된 해수를 연속희석법으로 분리 배양하여 미생물의 colony의 성상에 따라 총 14 균주를 분리하였다(Table 1).

Table 1.Marine bacteria isolated from the seawater samples

어류질병에 대한 항균활성 탐색

본 연구에서 항균활성 테스트 결과 MK-08은 S. iniae에서만 항균활성을 보였다. MK-11 균주는 S. parauberis, S. iniae, V. anguillarum에서 항균활성을 보였고 특히 S. iniae에서 가장 높은 항균활성을 나타났다. MK-08, MK-11 균주를 제외한 다른 균주에서는 항균활성이 나타나지 않았다. 이러한 결과를 토대로 S. iniae에 대하여 가장 우수한 항균활성을 보인 MK-11을 선정하여 최소억제농도를 측정한 결과 250 μg/ml의 농도로 나타났다(Table 2).

Table 2.The other bacteria strains didn’t show antibacterial acitivity. (ND) CY-2, Lactobacillus rhamnosus,IS-2, Bacillus sp.

또한 타 균주와의 항균활성 비교 결과 넙치 장으로부터 분리된 Lactobacillus rhamnosus CY-1, 발효식품으로부터 분리한 Bacillus sp. IS-2보다 MK-11이 높은 항균활성을 나타내었다. 또한 Gentamicin, Neomycin, Oxytetracycline과 비슷한 항균활성을 나타내었다(Table 3).

Table 3.Antibiotics resistance of Streptococcus iniae

형태학적 및 생화학적 동정

MK-11은 그람양성 간균의 형태를 보였으며, 크기는 2.0 μm으로 나타났다(Not data). Colony는 동그란 모양의 연한 노란색을 띄었다. 호기성을 띄었으며 Casein, Starch, Catalase 가수분해, Nitrate 환원 실험, Voges-prokauer test 및 Methyl Red test에도 모두 양성을 보였고, Tween 80을 수해시킬 수 있었으며, indole 생산능 및 탄소원으로써 citrate를 활용할 수 있었다 (Table 4). API 50CHB Kit를 사용하여 MK-11의 당 및 당 알코올 분해로 인한 산 생성능을 확인한 결과 D-mannitol과 D-sorbitol을 포함한 24개의 기질로부터 당자화에 의해 산을 생성하는 것으로 나타났다(Table 5).

Table 4.General physiological characteristics of isolated Paenibacillus sp. MK-11

Table 5.The biochemical characteristics of Paenibacillus sp. MK-11 by API 50CHB KIT test

최적배양조건 탐색

MK-11의 배양조건에 따른 생육 검토를 알아본 결과 20 ~ 35℃가 최적 생장온도로 나타났으며 25℃에서 가장 높은 생육도를 나타내었다(Fig. 1A). pH는 6.0에서 가장 높은 생육도를 보였으며(Fig. 1B), 1% NaCl이 첨가되었을 때 최고의 생육을 보였다(Fig. 1C). 최적 배지에서는 탄소원은 sorbitol (Fig. 2A), 유기질소원에서는 yeast extract (Fig. 2B), 무기염은 dipotassium phosphate (Fig. 2C)의 이용능이 높았다.

Fig. 1.The various cultivation test of the Paenibacillus sp. MK-11 strains. (A), 15~40℃; (B), pH 2.0~9.0; (C), NaCl 1~5%. The results showed highest with 25℃, pH 6.0, NaCl 1%.

Fig. 2.The best cultivation according to the various nutrient of Paenibacillus sp. MK-11 strans. (A), Carbon source: A: Glucose, B: Sorbitol, C: Mannose, D: Soluble starch, E: Lactose, F: Fructose, G: Sucrose, H: Control; (B), Nitrogen source: A: Yeast extract, B: Malt extract, C: Peptone, D: NaNO3 (=sodium nitrate), E: (NH4)SO4 (=Ammonium sulfate), F: Control; (C), Mineral source: A: NaCl (=Sodium chloride), B: MgSO4·7H2O (=Magnesium sulfate), C: CuSO4·5H2O (=Copper(II) sulfate), D: K2HPO4 (=dipotassium phosphate), E: FeSO4·7H2O (=Ferrous sulfate), F: Control. The results showed highest with sorbitol, yeast extract, K2HPO4.

16S rDNA계통분석

MK-11의 분석된 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과 Paenibacillus polymyxa (JF747221)와 99.78%, Paenibaciilus jamilae (AJ271157) 99.43%, Paenibacillus brasilensis (AF273740) 99.39%로 가장 높은 유사도가 나타났다(Fig. 3).

Fig. 3.Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence of Paenibacillus sp. MK-11. Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences showing the position of strain Paenibacillus sp. MK-11. Bootstrap percentage (from 1,000 replications)> 50% are shown at branch points.

고 찰

일반적으로 Paenibacillus sp.는 주로 토양[9, 21], 발효식품 [16], 식물뿌리[2], 해수퇴적층[12] 등 다양한 환경으로부터 분리되는 만큼 나타나는 항균물질도 매우 다양하다. 이전 연구 결과 발효식품으로부터 분리한 Paenibacillus sp.는 probiotics로 활용되고 있으며[3], P. polymyxa OSY-DF는 Polymyxin E1, Lantibiotic, Paenibacillin을 생산하여 식물의 세균성 질병에 대한 항균활성이 보고된 바 있다[7]. 그리고 토양에서 분리된 P. polymyxa JSa-9이 생산하는 Polymyxa B6와 P. polymyxa DY-5, DY-1의 경우 식물성 질병 중 그람양성균과 진균에 대한 항균활성을 보였다[4, 11, 21].

해수 퇴적층으로부터 Paenibacillus sp. 와 P. polymyxa가 분리되었으며[5], Paenibacillus sp.는 그람음성균인 Vibrio sp.에 대해 항균작용이 보고된 바 있으나[18], 그람양성균에 대한 항균활성 연구결과는 없었다. 또한 다양한 패턴의 항균작용을 갖는 Paenibacillus 속이 해수로부터 분리된 경우는 드물며, 어류질병에 관한 항균활성 연구 또한 미비한 실정이다. 따라서 본 연구는 해수로부터 분리한 Paenibacillus sp.를 이용하여 어류질병에 대한 항균활성을 평가하고자 하였다.

분리된 미생물 중 어류질병세균에 대해 항균활성을 보이는 균주를 선발하였고, 그 중 Paenibacillus sp. MK-11 균주가 그람양성균인 S. iniae에 가장 높은 항균활성을 보였다. 항생제 디스크와 비교한 결과 거의 비슷한 수준의 항균활성능을 보여주는 것으로 나타났으며, 이는 기존 항생제를 대체할 수 있는 가능성이 있는 것으로 사료된다.

S. iniae에 대한 항균활성이 있는 Lactobacillus rhamnosus CY-1 [20], Bacillus sp. IS-2 [8], 약용식물의 Ethanol 추출물과 Essential oil[17]보다 Paenibacillus sp. MK-11이 더 높은 활성을 나타났다.

최소억제농도를 측정한 결과 250 μg/ml로 나타났다. 이는 식물로부터 추출한 Essential oil의 320 μg/ml에 비해 낮은 농도임을 알 수 있었다[17].

API 50CHB Kit를 이용하여 당 및 당알코올로부터 산 생성능을 분석한 결과 토양에서 분리된 Paenibacillus polymyxa DY-1 와 비교하였을 때 D-mannitol과 D-sorbitol으로부터 산을 생성하지 못하였으나 본 연구에서 분리된 Paenibacillus sp. MK-11 산을 생성하는 것을 알 수 있었다[21].

항생제 내성균주인 MRSA (Methicillin Resistant Staphylococcus aureus)에 대하여 항균활성을 나타낸 P. incheonensis의 경우 NaCl 0~2%의 생육 범위[22]를 나타내었으나, 본 연구에서 사용한 Paenibacillus sp. MK-11은 최대 4%의 NaCl 첨가 배지에서 생장이 관찰되었다. 이는 실험균주의 생장에 어느 정도의 염분이 필요한 것으로 생각할 수 있다. 또한 pH는 4.0~8.0로 나타났다.

최적 배양조건에 있어 탄소원과 질소원에 따른 배양학적 차이도 알 수 있었다. 산간지대에서 분리한 Paenibacillus sp. BCNU5011 [9], 일반토양에서 분리된 P. incheonensis YK5 [22] 는 탄소원으로 Dextrose를 이용하는 반면 본 연구의 Paenibacillus sp. MK-11은 sorbitol의 이용능이 더 높았다. 유기질소원에서도 peptone의 이용능이 가장 높다고 보고됐지만[22], 분리된 Paenibacillus sp. MK-11는 yeast extract의 분해능이 더 높았다. 무기염에서는 dipotassium phosphate의 분해능이 높게 나타났다.

따라서 해수에서 분리한 Paenibacillus sp. MK-11은 이전 연구와 다른 다양한 생화학적 특성을 가지고 있으며, 주요 어류질병인 S. iniae에 대하여 높은 항균활성을 가지고 있는 것을 알 수 있었다. 추후 Paenibacillus sp. MK-11의 항균물질 추출과 항균작용기전, 항균물질의 독성에 대한 안전성 연구를 진행하여 양식산업에 적용하여 항생물질로서의 이용 가능성을 평가하고자 한다.