재료 및 방법

실험 재료 − 본 실험에 사용한 삼채(Allium hookeri)는 전라북도 순창군 농업기술센터의 형태학적 평가를 통해 동정 된 것을 구입하였고, 증거표본(RDAAH15)은 농촌진흥청 국립농업과학원 농식품자원부에 보관하였다. 삼채는 세척 후 잎과 뿌리로 나눠 동결건조(PVTFD 10R, Ilsin Lab, Yangju, Korea)하였고, 발효삼채(특허출원번호 10-2014-0154145)는 전북대학교 헬스케어기술사업단에서 제공받아 사용하였다. 삼채 잎, 뿌리 및 발효삼채는 각각 균일하게 40 mesh 분쇄기(FM909T, Hanil, Wonju, Korea)를 이용하여 분쇄한 후, -75℃에서 보관하며 본 실험에 사용하였다.

실험 동물 및 식이 − 본 실험에 사용된 제 2형 당뇨모델인 C57BLKS/J mouse(5주령, 수컷)는 ㈜중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 구입하여 1주일간 일반사료로 사육하였고, 체중에 따른 난괴법(randomized block design)으로 8마리씩 5군으로 분류하여 8주간 사육하였다. 비만을 유발하기 위한 실험식이로는 Research diets사의 고지방 식이(45% of energy as fat, D12451)를 이용하였고, 음성대조군(Cont)을 제외한 삼채 잎군(AL), 삼채 뿌리군(AR) 및 발효삼채 뿌리군(FAR) 은 고지방 식이에 삼채의 잎, 뿌리 및 발효 뿌리를 각각 실험식이의 3% 수준에서 첨가하여 공급하였다. 양성대조군은 항 당뇨 관련 건강기능식품의 기능성 원료인 난소화성 말토덱스트린((주)허브큐어, Korea)을 실험 식이의 3% 수준에서 배합하여 공급하였다. 동물 사육실 온도는 20±2℃, 습도는 50±5%, lighting cycle은 12시간 주기로 일정하게 유지시켰으며, 물과 식이는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험 식이는 사육기간 동안 냉장 보관하였고, 식이섭취량은 매일 일정한 시간에 측정하였으며, 급여량에서 잔량을 빼서 계산하였다. 본 실험은 농촌진흥청 국립농업과학원 동물실험윤리위원회의 승인(NAAS201413)절차에 따라 수행하였다.

실험동물의 시료 채취 − 마우스는 실험종료 12시간 전에 절식 시킨 후, 체중을 측정하고 CO2 마취 후에 심장 채혈법으로 채혈하였다. 채취된 혈액은 원심분리용 시험관에 담아 분리(3,000 rpm, 4℃, 20분)하였고, 획득된 혈청은 생화학적 분석을 위한 시료로 이용하였다. 실험동물의 장기조직은 채혈 후 즉시 적출하여 생리식염수로 세척 후에 표면의 수분을 제거하여 무게를 측정하였고, 액체질소로 급속 냉동시켜 -75℃에 보관하였다.

혈청 지질 분석 − 혈청 지질 함량은 중성지방 정량용 kit(Triglyceride assay kit, abcam, USA), 총 콜레스테롤 정량용 kit(AM 202-k, Asan Co., Seoul, Korea) 및 HDL/LDL-콜레스테롤 정량용 kit(ab65390, abcam, USA)를 사용하여 분석하였으며, microplate reader(Molecular device, Silicon Valley, CA, USA)를 이용하여 각각 550, 500 및 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

간 및 변의 지질성분 분석 − 지질 분석을 위하여 간 0.5 g 에 1.5mL의 0.9% 생리식염수를 가하고 plastic homogenizer probes(Hard Tissue Omni TipTM, OMNI International, Marietta, GA)를 이용하여 마쇄하였으며, 변은 오븐에서 건조하여 분쇄한 후 0.5 g을 취하여 사용하였다. 총지질 성분은 간 및 변 시료에 chloroform과 methanol 혼합액(2:1, v/v) 을 가하고 혼합한 후 추출하였고, sodium sulfate를 이용한 여과, 50℃의 항온수조에서 건조를 통해 얻어졌다. 총지질은 0.5%의 triton X-100가 함유된 ethanol 혼합액으로 녹이고, 중성지방과 총 콜레스테롤 측정을 위한 시료로 사용하였다. 간 및 변 중의 중성지방과 총 콜레스테롤의 측정방법은 앞의 혈청 지질 분석과 같은 방법으로 수행하였다.

간의 조직학적 변화 관찰 − 간 조직의 형태학적 관찰을 위해, 간 중엽 일부를 10%(w/v)의 중성 formalin 용액에 24시간 동안 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음에 파라핀으로 포매하였다. 그 후 rotary microtome(Jung Histocut 820, Leica, German)으로 7 μm 두께로 절편을 만들어 일반적인 조직학적 구조를 관찰하기 위한 hematoxylin & eosin(H&E) 염색을 시행하고, 광학현미경(Axioskop 50, Carl Zeiss, Jena, Germany)으로 조직의 변화를 관찰하였다.

간 조직 내의 지방세포 변화를 관찰하기 위하여, 간 중엽 일부를 Bouin’s solution과 20%(w/v) sucrose용액에 24시간 고정하였고, 고정된 조직은 냉동절편기(CM 3050 cryostat, Leica Inc., Bannockburn, IL, USA)를 이용하여 20 μm의 두께로 절단하였다. 준비된 절편은 자유부유법(free-floating method)을 이용하여 Oil-red O로 염색하였으며, 간조직내 지질의 조직학적 변화를 광학현미경을 이용해 관찰하였다.

통계처리 − 모든 실험 결과는 SPSS package program (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용한 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시한 후, 평균과 표준오차로 제시하였고, 실험 군 사이의 통계적 유의성(p<0.05)은 Duncan’s multiple range test 로 검증하였다.

결과 및 고찰

체중 증가량 및 장기의 무게 − 고지방 식이에 삼채 잎, 뿌리 및 발효뿌리 분말을 첨가하여 당뇨마우스에게 8주간 급여하였을 때의 체중증가량 및 장기의 무게는 Table I과 같다. 실험 초기의 체중은 28.2~29.0 g으로 모든 실험군 사이에 차이가 없었으나(제시하지 않음), 실험식이 급여 후의 체중 증가량은 발효삼채 뿌리 섭취군에서 대조군에 비하여 낮게 나타났다. 이것은 김 등의 연구에서 삼채의 잎 및 뿌리가 체중에는 영향을 주지 않았던 것9)과는 비교되는 결과로, 삼채 뿌리를 발효처리 할 경우 체중 감소 효과가 있는 것으로 생각된다. 간 무게는 모든 실험군 사이에 차이를 보이지 않았으나, 발효 삼채 뿌리 섭취군에서 부고환주변 지방의 무게가 유의적으로 감소하였고, 이것이 체중 증가량의 감소와 관련된 것으로 보인다.

Table I.All values are mean±S.E. 1)AL: Allium hookeri, leaf 2)AR: Allium hookeri, root 3)FAR: Allium hookeri, fermented root a,b; Values with different superscripts in the same column are significantly different (p<0.05) among groups by Duncan's multiple range test.

실험동물에서 체중증가량이 낮은 것은 실험식이의 효율이 낮아 체중 증가 억제 효과가 있는 것으로, 윤 등의 연구에서도 섬더덕 추출물의 급여가 최종 체중을 감소시켰다.15) 강 등의 연구에서는 열량의 40% 고지방식이에 글루칸 첨가식이(5%, w/w)를 실험동물에게 6주 동안 공급하였을 때, 유의하지는 않았지만 부고환 조직의 무게가 대조군보다 낮았음을 보고하였다.16) 그러나 조 등의 연구에 따르면, 콜레스테롤이 첨가된 고지방 식이를 4주 동안 실험동물에게 급여하였을 때, 과량의 지방과 콜레스테롤이 간 조직 내에 축적되어 간조직의 중량이 증가되었다.17) 따라서 고지방 조성외에도 콜레스테롤의 첨가가 실험동물의 체중 증가나 간 등의 장기무게를 증가시키는데 효과가 있어, 비만 및 지방간을 갖는 동물모델 개발에 유용할 것으로 생각된다.

혈청 지질 수준 − 혈청 중성지방, 총콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤의 농도를 Table II에 나타내었다. 표에서 보여주는 것과 같이, 모든 삼채 섭취군에서 대조군에 비하여 혈청 총콜레스테롤과 LDL-콜레스테롤 농도가 낮은 경향을 보였고(p>0.05), HDL-콜레스테롤의 농도는 유의적으로 높게 나타났다. 특히 발효 삼채 뿌리는 혈청 총 콜레스테롤 농도를 대조군에 비하여 13% 낮추면서, HDL-콜레스테롤의 농도를 높이는 효과가 있었다. 본 연구에서 삼채 잎 및 뿌리의 혈중 지질 수준 저하 효과는 약하였으나, 삼채의 실험식이 중의 급여 수준 및 급여 기간에 따라 유의한 영향을 미칠 수 있은 가능성이 제시되었다.

Table II.All values are mean±S.E. 1)AL: Allium hookeri, leaf 2)AR: Allium hookeri, root 3)FAR: Allium hookeri, fermented root a,b; Values with different superscripts in the same column are significantly different (p<0.05) among groups by Duncan's multiple range test. NS; Not significant

간의 지질 수준 − 삼채 잎, 뿌리 분말과 발효뿌리 분말을 첨가한 고지방식이를 섭취한 마우스의 간지질 농도를 측정 한 결과는 Table III과 같다. 간의 총지질, 중성지방 및 총콜레스테롤 함량은 삼채 뿌리를 섭취한 실험군에서 낮아지는 경향을 보였으나(p>0.05), 모든 실험군 사이에 유의한 차이를 보이지는 않았다. 삼채와 같은 Allium속의 식물인 마늘을 실험식이에 첨가(3%, w/w)하여 실험동물에 급여하였을 때에도 간의 중성지방과 총 콜레스테롤의 함량에는 차이가 없었다고 보고되었다.18) 따라서 삼채의 공급은 본 실험에 이용된 당뇨 마우스의 간 지질수준에 유의적인 영향을 주지는 않았으나, 고콜레스테롤 실험식이17)나 8주 이상의 장기간 실험식이 급여에서는 다른 결과가 나올 수도 있었을 것으로 생각된다.

Table III.All values are mean±S.E. 1)AL: Allium hookeri, leaf 2)AR: Allium hookeri, root 3)FAR: Allium hookeri, fermented root NS; Not significant

간 조직의 형태학적 변화 − 삼채 잎, 뿌리 및 발효뿌리 분말이 첨가된 고지방 식이를 섭취한 마우스 간 조직의 형태학적인 변화를 Fig. 1에 나타내었다. 간 조직의 병리학적 검사결과, Cont군에서 균일하게 세포크기가 증가된 간세포를 확인 할 수 있었으며, Dex군은 Cont군보다 간세포의 크기가 감소되었다. 특히, FAR군의 경우 Cont군과 Dex군에 비해 간세포의 크기가 감소되고 세포질과 핵이 많이 관찰되는 것으로 보아 염증 및 간세포의 괴사가 적은 것으로 나타났다. 그리고 AL군 및 AR군에서는 간세포의 크기 증가 보다는 부분적으로 공포화가 관찰되었다.

Fig. 1.Comparison of histological change and fat accumulation in liver of diabetic mice fed experimental diets for 8 weeks. A, Hematoxylin & eosin staining (×200); B, Oil-red O staining (×200); Cont, Control; Dex, Dextrose; AL, A. hookeri, leaf; AR, A. hookeri, root; FAR, A. hookeri, fermented root

간 조직 절편의 Oil-red O 염색에 의한 검사결과, Cont군에서는 큰 지방입자들이 중심정맥을 따라 균일하게 분포되어 있었고, Dex군은 Cont군에 비해 지방입자의 수가 감소 되었으나, 지방입자의 크기에는 Cont군과 차이가 없었다. 또한 AL군, AR군과 FAR군에서의 지방입자의 크기와 수는 Dex군과 Cont군보다 감소한 것으로 나타났다. H-E염색 처리된 AL군과 AR군에서 공포가 발견되었으나, Oil-red O 염색을 이용한 지방 염색에서 큰 지방입자가 발견되지 않았으므로 지질을 제외한 다른 원인에 의해 공포가 진행된 것으로 생각된다.

변 중 지질 배설 − 삼채 잎과 뿌리 및 발효뿌리 분말이 첨가된 고지방식이를 섭취한 마우스의 변 중 지질 배설량에 대한 결과는 Table IV과 같다. 변으로 배설된 총지질 및 중성지방 함량은 AL군과 FAR군에서 유의적으로 증가하였으나 총 콜레스테롤 함량에는 실험군 사이에 유의한 차이를 보이지 않았다. 국산 삼채 뿌리는 건조중량 100 g당 711 mg의 황 및 4556 mg의 조사포닌을 함유하고 있어 도라지(57mg/100 g), 흑도라지(107.9 mg/100 g) 및 팽화도라지(1880-2170 mg/100 g)의 조사포닌 함량보다 높고, 백삼 및 홍삼의 조사포닌 함량(3362-4423 mg/100 g)과 유사하여 높은 생리활성을 기대할 수 있을 것으로 보고되었다.19) 김 등의 연구에서도 대두박 사포닌의 급여수준이 높아질수록 변중의 중성지질 함량이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다.20) 따라서 고지방식이와 함께 급여된 AL 및 FAR이 분변으로의 총 지질 및 중성지방 배설량을 증가시키며, 식이지방의 흡수를 효과적으로 저해한 것으로 보인다.

Table IV.All values are mean±S.E. 1)AL: Allium hookeri, leaf 2)AR: Allium hookeri, root 3)FAR: Allium hookeri, fermented root a,b; Values with different superscripts in the same column are significantly different (p<0.05) among groups by Duncan's multiple range test. NS; Not significant

따라서 발효 삼채 뿌리는 변으로의 지질 배설을 증가시킴으로써, 혈중 지질, 지방조직의 무게 및 체중 증가량을 효과적으로 조절하는 기능이 있는 것으로 보인다. 또한 발효삼채는 발효 과정에서 일반 삼채보다 구수한 맛이 증가하고, 자극적인 향이 적은 것으로 알려져 있어(특허출원번호 10-2014-0154145), 비만 예방 및 체내 지질 감소를 목적으로 하는 다양한 제품 개발이 기대된다.

결 론

본 연구에서 국산 삼채는 제 2형 당뇨마우스에서 체중증가량을 감소시키고, 체지방 및 혈중 지질 수준을 조절하는 효과가 있었으며, 이것은 변중 지질 배설량을 증가시키는 기전에 의한 것으로 나타났다. 따라서 삼채는 그동안 보고 된 혈당 저하, 항염 및 항산화 등의 효과 외에, 체내 지질함량 및 지질 프로파일을 조절하는 효과가 있고, 특히 발효삼채가 우수하여, 앞으로 비만 및 당뇨 환자들을 위한 건강기능식품의 소재로 이용될 수 있을 것이다. 그러나 우리 환경에 맞는 삼채의 품종 개발 및 등록이 필요하고, 다양한 동물 모델에서 분자 수준의 기전 설명을 위한 연구가 수행되어야 할 것으로 생각되며, 국산 삼채의 부가가치 향상 및 우리 농산물의 국가 경쟁력 향상을 위한 농업인, 연구소 및 업체 등의 협력이 요구된다.