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최근 서구화된 식습관과 생활환경의 변화로 전 세계적으로 비만이 심각한 질환으로 대두되고 있다(No, 2012). 비만은 신체 에너지의 섭취와 소비의 불균형으로 생기는 질환으로 고혈압, 고지혈증, 당뇨 및 심혈관질환과 같은 성인병 발생 가능성을 증가시키는 요소로 밝혀지고 있다(Spiegelman and Flier, 2001). 그로 인해 현재 다양한 비만 관련 치료제가 출시되고 있지만, 이들은 지방변, 두통, 오심, 우울증, 불안 및 인지 관련 증상 등의 부작용이 보고되고 있다(Ballinger and Peikin, 2002; Lee, 2013). 따라서 이러한 부작용이 적으면서 우수한 효과를 기대할 수 있는 천연물을 이용한 항비만 식이 개발이 요구되는 실정이다(Kim et al., 2010; Jeon et al., 2014; Choi et al., 2013; Shon et al., 2013).

지방세포 내의 지방구(lipid droplet)는 지질의 대사와 조절등 지방대사에 중요한 역할을 하고, 지방구에 축적되는 지질은 중성지방의 분해와 합성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 따라서 비만 예방 및 관리에 있어 지방전구세포로부터 분화된 지방 세포의 형성 억제와 지방구 내에 존재하는 중성지방의 분해로 인한 glycerol의 유출과정은 중요한 기전이며(Frayn et al., 2003), 이 때 다양한 전사인자와 호르몬이 관여한다. AMP-activated protein kinase (AMPK)는 지방산의 합성과 분해를 매개함으로써 체내 에너지 항상성 유지의 중요한 역할을 한다(Assifi et al., 2005). 활성화된 AMPK는 sterol regulatory element binding protein-1c (SREBP-1c), peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) 및 fatty acid synthase (FAS)와 같은 지방세포화 인자의 발현을 억제함으로써 지방 합성을 억제시키고 acetyl-CoA carboxylase (ACC)의 비활성화와 carnitine palmitoyltransferase-1 (CPT-1)의 활성화를 통해 베타-산화를 촉진시켜 미토콘드리아로 지방산 이동을 증가시킨다(Hardie, 2003; Foretz et al., 1998; Park et al., 2015). 분화 초기에는 CCAAT/enhancer-binding protein β (C/EBPβ), C/EBPδ와 SREBP-1c가 발현되고, 이들 전사인자는 후기전사인자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 유도하여 지방전구세포의 분화를 촉진하며 섭취된 에너지원으로부터 중성지방의 합성을 촉진하여 지방과 간 조직에 저장한다(Cao et al., 1991; Naowaboot et al., 2012). 또한, SREBP-1c는 FAS, ACC 및 acetyl-CoA synthase (ACS) 등의 발현을 조절하여 지방산과 중성지방의 합성을 조절하게 된다(Kolehmainen et al., 2001). 따라서 항비만 기능성 소재개발 연구는 지방세포의 분화과정을 억제하거나 지방분해를 촉진하는 소재를 탐색하는 연구가 진행되어야 한다.

본 연구에서 사용한 비타민나무(Hippophae rhamnoides L.)는 보리수나무과(Elaeagnaceae)의 낙엽성 관목으로 북아시아와 유럽이 원산지이고, 산자나무, 갈매보리수나무 등으로 불리며(Rousi, 1971), 항산화, 항미생물, 항염증, 항암, 위궤양 치료, 간세포 보호, 면역조절 및 피부보호 효과 등이 알려져 있다 (Chauhan et al., 2007; Zu et al., 2006; Ganju et al., 2005; Xing et al., 2002; Suleyman et al., 2001). 화학성분은 폴리페놀류, flavonoid, flavonoid 배당체, pomolic acid, vomifoliol, β-sitosterol, protocatechuic acid 및 ursolic acid 등이 알려져있다(Yang et al., 2013; Maheshwari et al., 2011). 비타민나무잎 추출물에 존재하는 flavonoid는 주로 quercetin, kaempferol 및 isorhamnetin으로, 이 성분들은 지방세포 분화 및 지방 축적억제 효과가 있다고 알려져 있다(Yang et al., 2011; Jang and Jeong, 2010; Bae et al., 2014). 비타민나무 잎의 항비만 연구로는 덖음차 추출물의 간장 지질 관련 효소 활성(phosphatidate phosphohydrolase (PAP), fatty acid β-oxidation (β-oxidation), CPT, malic enzyme 등)을 측정하여 내장비만의 억제효과를 확인하였으며(Lee et al., 2011), 에탄올 추출물을 대상으로 PPARα, CPT-1, ACC의 mRNA 발현을 확인하여 지방산 산화로 인한 항비만 효과가 나타났음을 in vivo 연구로 확인하였다(Pichiah et al., 2012). 또한 비타민나무 잎의 주성분인 flavonoid, tannin등을 대상으로 지방축적 억제효과를 확인하였고(Yang et al., 2013), polymethoxylated flavonoid인 pentamethylquercetin을 대상으로 aiponectin 및 PPARγ 등의 mRNA와 단백질 발현을 확인하여 혈당강하 효과를 확인하였다(Chen et al., 2011). 하지만 비타민나무 잎 추출물의 지방 생성 및 축적 저해에 의한 항비만 작용기전 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 비타민나무 잎 추출물을 이용하여 지방전구세포의 분화 억제능과 세포 내 중성지방의 생성 및 축적과 관련된 작용기전을 분석함으로써 체지방 감소에 도움이 되는 기능성 식품 소재 개발을 위한 가능성을 규명하고자 하였다.

재료 및 방법

재료

본 실험에 시료로 사용된 비타민나무 잎(Hippophae rhamnoides L.)은 강원비타민나무영농조합(Chuncheon, Korea)에서 제공받아 사용하였고, 강원대학교 식물자원응용공학과 약용식물분류학실험실에서 동정 받았으며 증거표본은 강원대학교 식물자원응용공학과 식물표본실에 보관하였다. 본 실험에 사용된 mouse embryo 유래의 3T3-L1 지방전구세포는 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 분양 받았고, 세포배양에 사용한 Dulbeco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), bovine calf serum (BCS), penicilin/streptomycin solution (PS), phosphate buffered saline (PBS), trypsin-EDTA는 HyClone사(Logan, UT, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Insulin, 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), dexamethasone (DEX) 및 Oil Red O, 3-(4, 5-dimethyl thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyhl tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.

시료 제조

비타민나무 잎 추출물(HRL)은 파쇄된 시료에 10배수의 70% 에탄올을 첨가하여 상온에서 12시간씩 2회 반복하여 추출하였다. 추출액은 filter하여 불순물을 제거한 다음, 감압 농축하여 농축물을 얻었으며, 이를 동결 건조하여 사용하였다.

3T3-L1 세포 배양 및 분화(diferentiation) 유도

3T3-L1 지방전구세포는 10% BCS와 1% PS가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2의 조건에서 배양하였다. 세포의 분화는 2 × 104 cells/㎖의 농도로 6 well plate에 세포를 분주한 후, 100% confluent한 상태가 되도록 배양하였다. 2일 후 10% FBS, 1% PS 및 분화유도물질 MDI (0.5 mM IBMX, 1 μM DEX, 10 ㎍/㎖ insulin)가 첨가된 DMEM 배지를 처리하고, 그 이후 10% FBS와 10 ㎍/㎖ insulin만을 포함한 DMEM 배지로 교체하여 지방세포 분화를 유도하였다. 시료의 처리는 분화유도 배지첨가 시점부터 같이 처리하였다.

세포독성

HRL의 세포독성은 Ishiyanma et al. (1996)의 MTT assay로 실험하였다. 세포를 1 × 104 cells/well의 농도로 96 well plate에 100 ㎍씩 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하여 일정 농도로 희석된 추출물을 첨가한 후 다시 24시간 배양하였다. 배양 완료 후 5 ㎍/㎖ 농도의 MTT 시약을 100 ㎍씩 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 4시간 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO 100 ㎍를 가하여 생성된 formazan을 녹인 후 ELISA microplate reader (Model 680, Biorad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 다음의 식에 따라 계산하였다.

Cell viability (%) = ABSsample/ABScontrol × 100

ABSsample: Absorbance of the experimental sample ABScontrol: Absorbance of the control

Oil Red O 염색을 이용한 세포 내 중성지방 측정

HRL에 의해 지방세포 분화 시 나타나는 중성지방 축적 저해를 확인하기 위하여 3T3-L1 지방전구세포의 분화유도 시 추출물을 농도별(0, 10, 25, 50, 100 ㎍/㎖)로 처리하였다. 배지를 제거한 후, 10% formalin (Intron, Seongnam, Korea)을 처리하여 상온에서 1시간 고정시켰다. 고정 후 증류수와 60% isopropanol로 세척한 후 세포들을 완전히 건조시키고, Oil Red O working solution을 20분간 처리하여 세포 안에 축적된 지방구들을 염색하였다. 현미경을 사용하여 염색된 세포를 관찰한 후, 100% isopropanol을 이용하여 세포 내 염색되어 있는 Oil Red O를 용출시켜 510 ㎚에서 흡광도를 측정하여 지방 축적을 확인하였다.

RT-PCR을 이용한 mRNA 분석

지방세포 분화가 완료된 세포를 PBS로 세척하여 harvest 한 후 Total RNA Extraction Kit (Intron)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 추출된 RNA를 이용하여 cDNA를 합성한 후 template로 사용하여 지방세포 분화 발현 인자인 SREBP-1c, PPARγ, C/EBPα를 확인하고, 지방 축적, 합성 및 저장에 관련된 FAS의 primer (Genotech, Daejeon, Korea)를 이용하여 RT-PCR을 실시하였다. Primer 염기서열은 Table 1과 같고, PCR 조건은 초기변성 94℃ 5분, 변성은 94℃ 30초, annealing은 56℃ (PPARγ), 58℃ (SREBP-1c, FAS), 60℃ (C/EBPα) 60초, 신장반응은 72℃ 60초로 하여 35cycle을 진행하였다. 데이터는 UVIband Software (UVItec, Cambridge, UK)로 분석하였으며 유전자의 발현량은 differentiation media만 처리한 대조군을 1.0으로 간주하여 상대적인 값을 측정하였다.

Western blot을 통한 단백질 발현 분석

분화된 3T3-L1 세포를 harvest 하여 lysis buffer (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)를 넣고 30분간 용출시킨 후 13,000 × g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 얻었다. 정량한 단백질은 4-20% SDS-polyacrylamide gel (Biorad Laboratories Inc.)을 사용하여 전기영동 후 PVDF membrane (Biorad Laboratories Inc.)에 transfer 하였다. 5% Skim milk (0.1% Tween 20 containing PBS, PBST) 용액에서 1시간 동안 nonspecific binding site를 blocking한 뒤 1차 항체[anti-PPARγ, anti-AMPK, anti-β-actin (1:1000), Cell Signaling Technology]로 4℃에서 overnight하고 2차 항체[anti-rabbit IgG or anti-mouse IgG linked with horseradish peroxidase, Santa Cruz Biotechnology, Inc. USA]로 상온에서 1시간 incubation하였다. ECL solution (YoungInFrontier Co., Gasandong, Seoul, Korea)을 이용하여 antibody-bound protein을 detection하였다.

통계처리

모든 결과는 SAS (ver. 9.2, SAS Institute Inc., NC, USA) 통계프로그램을 이용하여 분석하였고 평균±표준편차로 표시하였으며, 실험군간 평균의 차이는 one-way ANOVA로 유의성을 확인하였다. 대조구인 분화 control에 대한 시료 처리구의 통계적 유의성은 Tukey’s multiple comparison test로 검정하였고 p < 0.05 이상일 때만 통계적 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

결과 및 고찰

세포독성

HRL이 3T3-L1 세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 MTT assay를 통해 세포독성을 측정하였다(Fig. 1). 추출물을 처리하지 않은 대조군의 세포 증식율을 100% 하였을 때, 100 ㎍/㎖의 농도에서 82.68 ± 1.35%로 80% 이상의 세포 생존율을 나타내었다. 식물 추출물에 의한 세포 생존율에 관한 연구를 보면 칡잎 추출물의 경우에는 100 ㎍/㎖ 농도에서 89.3%의 생존율을 나타내었으며(Lee et al., 2014), 두메부추 추출물의 100 ㎍/㎖ 농도에서 독성을 나타내지 않아(Choi and Kim, 2014a) 항비만제 및 원료개발에 있어서 유효한 물질의 가능성을 나타내었다. 따라서 본 연구는 세포증식에 크게 영향을 미치지 않는 100 ㎍/㎖ 이하의 농도 10, 25, 50, 100 ㎍/㎖로 3T3-L1 세포에 처리하여 지방세포 분화 억제능을 확인하였다.

Fig. 1.Effects of HRL (extract of Hippophae rhamnoides L. leaves) on cell viability. 3T3-L1 cells were treated with different concentrations (0~100 ㎍/㎖) of HRL for 24 h. Cell viability was measured by MTT assay. The viability of untreated control cells was defined as 100%. Each bar represents the mean ± SEM (n = 3). * p < 0.05, ** p < 0.01 compared to control cells.

중성지방 축적 억제 효과

Oil Red O 염색시약은 중성지질, 콜레스테롤만을 염색하고, 세포 내 축적된 지방구의 중성지방을 염색하여 세포의 붉은색 정도를 통해 분화 정도를 확인할 수 있다(Choi et al., 2013). 따라서 3T3-L1 세포 분화 과정에서 HRL이 지방구 생성을 억제하는지 확인하기 위해 Oil Red O 염색법을 이용하였다. 분화처리군(Con)의 경우, 세포질 내 지방구의 형성이 활발하게 유도되는 것을 확인하였고, HRL을 10, 25, 50, 100 ㎍/㎖ 로 처리하였을 때 농도 의존적으로 붉은색이 적게 관찰되어 지질 축적이 감소함을 확인하였다(Fig. 2). 이를 정량 분석한 결과, 분화처리군 (Con)에 비해 HRL 25, 50, 100 ㎍/㎖ 처리군이 각각 20.76, 45.29 및 82.25%로 중성지방 축적을 억제하는 것으로 나타났다 (Fig. 2). 이는 Yoon et al. (2010)이 보고한 목향추출물의 경우 100 ㎍/㎖에서 약 10% 축적 억제를 나타낸 연구결과와 비교하였을 때 HRL의 우수한 지방분화능 억제 효과를 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 비타민나무에서 존재하는 quercetin, kaempferol 및 isorhamnetin 등의 flavonoid 성분의 영향으로 생각되며, Yang et al. (2013)의 보고에 따르면 비타민나무에서 분리된 quercetin, kamepferol 및 isorhamnetin 등의 성분이 각각 45.6, 42.2 및 44.3% (30 μM)의 중성지방 축적 억제효과를 나타내는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과로 HRL 처리가 지방구의 생성을 저해시켜 지방 축적을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

Fig. 2.Effect of the HRL (extract of Hippophae rhamnoides L. leaves) on the lipid accumulation in 3T3-L1 cells. Differentiation of confluent 3T3-L1 cells was initiated in DMEM containing MDI (0.5 mM IBMX, 1 μM DEX and 10 ㎍/㎖ insulin). Following 10-day differentiation, differentiated adipocytes were fixed and stained with oil-red O in order visualize lipid droplets. Pre, preadipocyte; Con, differentiated adipocyte. Each bar represents the mean ± SEM (n = 3). * p < 0.05, ** p < 0.01 compared to differentiated adipocyte (Con).

RT-PCR을 이용한 mRNA 발현량 측정

Adipogenesis는 지방전구세포가 지방세포로 분화되는 과정으로, 이를 직간접적으로 조절하는 유전자 및 단백질들이 최근 다양한 연구로 인해 잘 알려져 있으며(White and Stephens, 2010), SREBP-1c, C/EBP family, PPARγ 등이 있다. SREBP-1c는 지방산이나 콜레스테롤 합성에 필수 전사인자이고(Park, 2005), 지방세포에서 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 유도하여 지방생성을 촉진시키며, 지방산 생성에 관여하는 효소인 FAS와 ACC 등의 발현을 조절한다(Fajas et al., 1999). PPARγ는 adipogenesis 과정에서 aP2 promoter 위치에 결합하여 adipogenesis를 조절하고, C/EBPα는 PPARγ와의 강한 상승작용을 통해 지방전구세포의 분화후기 과정을 촉진한다(Hauser et al., 2000; Darlington et al., 1998). 따라서 본 연구에서는 HRL에 의한 지방전구세포의 분화억제 효과를 확인하기 위하여 adipogenic transcription factor 및 관련 유전자들의 발현을 RT-PCR을 이용하여 확인하였다(Fig. 3). 그 결과 분화를 유도한 대조군 그룹(Con)에서 SREBP-1c, PPARγ, C/EBPα 및 FAS의 mRNA발현이 증가하였으나, 분화과정에서 HRL을 처리하여 분화를 유도한 경우 SREBP-1c, PPARγ, C/EBPα 및 FAS의 mRNA 발현이 모두 농도 의존적으로 감소하였음을 확인하였다(Fig. 3). 특히, HRL 100 ㎍/㎖의 농도에서 SREBP-1c, PPARγ 및 C/EBPα는 분화처리군(Con) 대비, 각각 0.87, 0.91 및 0.35배 감소하였으며(Fig. 3), 이들 전사인자들의 하위 인자인 FAS의 mRNA 발현도 0.49배 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3D). 이전의 연구는 비타민나무 잎 에탄올 추출물이 PPARα 및 CPT-1의 발현 증가에 영향을 미쳐 지방산 베타-산화를 촉진시킴으로써 항비만 효과를 나타낸다고 보고된 바 있고(Pichiah et al., 2012), 덖음차 추출물식이그룹에서 PAP, β-oxidation 및 CTP의 활성을 저해시켜 fatty acid esterification pathway를 통한 혈당강하 효과를 나타낸다고 보고된 바 있으나(Lee et al., 2011), 본 연구에서는 비타민나무 잎 에탄올 추출물이 SREBP-1c, PPARγ, C/EBPα 및 FAS의 발현을 감소시켜 지방 합성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. Park et al. (2013)에 의하면 지방세포 분화는 adipogenic transcription factor와 지방 형성 관련 효소의 상호작용으로 조절되고 SREBP-1c, PPARγ 및 C/EBPα의 발현 억제로 지방세포의 분화를 억제한다고 보고된 바 있으며 이 외에도 본 연구결과는 adipogenic transcription factor의 발현 억제를 통한 지방세포 분화 억제를 제시한 Kim et al. (2014), Hwang et al. (2014) 및 Choi and Kim (2014b)의 보고와 일치한다. 따라서 HRL은 3T3-L1 지방전구세포에서 adipogenic transcription factor인 SREBP-1c의 발현을 억제시킴으로써 SREBP-1c의 타겟유전자이며 지방형성 과정에 주요 인자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하고 지질의 합성 수송, 저장에 관여하는 FAS의 발현에 영향을 미쳐 지방분화를 억제를 이끌어 세포 내 중성지방의 축적이 감소되는 것으로 사료된다.

Fig. 3.Effects of HRL (extract of Hippophae rhamnoides L. leaves) on adipogenic genes expression in 3T3-L1 cells. Differentiation of confluent 3T3-L1 cells was initiated in DMEM containing MDI (0.5 mM IBMX, 1 μM DEX and 10 ㎍/㎖ insulin). Total RNA was extracted and cDNA was prepared. Equivalent amounts of cDNA were amplified using primers specific for SREBP-1c (A), PPAR-γ (B), C/EBP-α (C), FAS (D), and GAPDH. Pre, preadipocyte; Con, differentiated adipocyte. Each bar represents the mean ± SEM (n = 3) * p < 0.05, ** p < 0.01 compared to differentiated adipocyte (Con).

Western blot을 이용한 단백질 발현량 측정

HRL의 지방 생성 및 분해와 관련된 단백질 발현과의 연관성을 확인하기 위해 western blot을 이용하여 AMPKα, PPARγ의 발현량을 측정하였다(Fig. 4). AMPK는 세포 내의 에너지 항상성 유지 역할을 하는 효소로 지방의 대사조절에 중요한 역할을 한다. AMPK는 AMP가 증가되면 인산화를 통해 활성화되고 지방산 산화를 증가시키며 지방 합성을 억제한다. AMPK는 활성화 되어 SREBP-1c, PPARγ 및 FAS와 같은 지방세포화 인자의 발현을 억제함으로써 지방 합성을 억제시키고 ACC의 비활성화와 CPT-1의 활성화를 통해 베타-산화를 촉진시켜 미토콘드리아로 지방산 이동을 증가시킨다(Hardie, 2003; Foretz et al., 1998; Fryer, 2002). HRL을 농도별로 처리한 결과, AMPK 및 PPARγ의 발현이 유의성 있는 변화를 나타냈고, P-AMPK의 발현은 100 ㎍/㎖의 농도에서 3.5배 증가되는 것을 확인하였으며 PPARγ의 발현은 0.1배 감소되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 비타민나무 잎에 존재하는 quercetin의 영향으로 생각된다. Ahn et al. (2008)의 연구에 따르면 quercetin이 AMPK의 발현을 증가시켜 adipogenesis를 억제시키고, PPARγ, C/EBPα, SREBP-1 및 FAS의 발현 감소로 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 억제시킨다고 보고된 바 있다. 따라서 HRL은 활성화된 AMPK의 발현을 증가시킴으로써, 지방형성 과정에 주요 인자인 PPARγ의 발현에 영향을 준 것으로 생각되며, 이는 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로의 분화 억제를 이끌어 세포 내중성지방의 축적이 감소되는 것으로 판단된다.

Fig. 4.Effects of HRL (extract of Hippophae rhamnoides L. leaves) on adipogenic protein expression in 3T3-L1 cells. Differentiation of confluent 3T3-L1 cells was initiated in DMEM containing MDI (0.5 mM IBMX, 1 μM DEX and 10 ㎍/㎖ insulin). Western blot was performed using P-AMPKα (A), AMPKα (B), PPARγ (C), and β-actin. Pre, preadipocyte; Con, differentiated adipocyte. Each bar represents the mean ± SEM (n = 3). * p < 0.05, ** p < 0.01 compared to differentiated adipocyte (Con).