서 언

Melanin은 생물체에 널리 분포되어 있으며, 사람의 피부색 및 머리카락, 눈동자의 색을 결정하는 주요 인자 중 하나로서 피부의 표피층에 존재하는 melanocyte에서 합성된다(Seiberg, 2001; Ando et al., 2012). Melanin 합성은 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TYRP-1), tyrosinase related protein-2 (TYRP-2)와 같은 효소들에 의해 이루어지며 이들은 tyrosine 을 3,4-dihydroxy-phenylalanine (DOPA)를 거쳐 DOPA quinone으로 전환하고 붉은 계열의 eumelanin과 갈색계열의 pheomelanin이 합성시킨다. microphthalmia-associated transcription factor (MITF)는 TYRP-1, TYRP-2, tyrosinase 등 효소들의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 이유로 MITF 및 melanin형성 관련 효소들을 저해하는 것은 미백기능성을 증명하는데 주요한 요인이다(Bentley et al., 1994; Hemesath et al., 1998; Wu et al., 2000; Park et al., 2009; Olivares and Solano, 2009; Ahn et al., 2015).

피부 탄력성은 진피조직의 두께로 결정되며, 이는 진피조직을 형성하는 collagen 형성과 밀접한 관계가 있다. 이러한 collagne의 억제와 파괴증가는 탄력성을 저하시켜 주름 형성의 주요한 요인으로 작용한다(Lee et al., 2003). 따라서, collagen 생성을 촉진 하는 것은 주름생성을 억제할 수 있다(Fisher et al., 1999; Kim et al., 2015).

현재 arbutin, kojic acid, linoleic acid를 포함하는 많은 tyrosinase 저해제가 의약부외품과 기능성 화장품의 미백 원료로 광범위하게 사용되고 있으나, 의학계나 화장품업계에서는 피부 안정성, 제형 안정성 등의 문제로 제한된 양만 사용되고 있다(Chun et al., 2002; Seo et al., 2003). 따라서 안전성이 높은 천연물질을 이용한 기능성 제품 개발이 필요하다(Park et al., 2013).

Dendrobium speciosum은 난초과의 여러해살이풀로, 호주 동부에서 자생하는 대형종 난이다. 가인경(假麟莖)은 45 ㎝ 정도까지 달하며, 각각의 가인경 끝에 2~5개의 두툼한 잎이 달린다. 이러한 Dendrobium speciosum의 약리작용에 대한 연구는 동속에 속하는 석곡(Dendrobium moniliforme)과 달리 항산화 또는 항유전독성 효능에 대해서 보고되어져 있으며(Moretti et al., 2013), 대부분 관상용으로 판매 유통되고 있어 산업화와 관련된 기능성 연구가 미흡한 실정이다. 이에 본 연구에서는 Dendrobium speciosum의 추출물을 활용하여 미백효능 및 주름개선을 평가하여 향후에 제품화 소재로 이용하고자 하였다.

재료 및 방법

실험 재료

Dendrobium speciosum는 경남 거제 일운 화훼작목반에서 구입하여 전남한방산업진흥원 유리온실에서 생육시켜 정선, 수세 후 건조하여 분쇄기를 이용하여 균일하게 분쇄한 후 70% EtOH를 칭량한 시료무게의 10배를 넣고 환류냉각으로 3시간, 3회 반복하여 추출물을 제조하였다. 이 추출물을 감압농축기 (NE-10001V, Eyela, Japan)로 농축하여 완전히 용매를 제거한 시료를 실험 목적에 맞춰서 용매에 녹여 실험에 사용하였다.

시약

Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)과 fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycin, Medium 106, Low Serum Growth Supplement는 Gibco/BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였고, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS, CellTiter 96AQueous One Solution Cell Proliferation Assay)는 Promega (Madison, WI, USA)에서 구입하였다. α-MSH와 L-DOPA는 Sigma Chemical Co. (St. Lousi, MO, USA) 에서 구입하였다. Procollagen type I C-prtide EIA kit는 Takara (Shiga, Japan)에서 protein 정량에 사용하는 Bradford 시약은 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA)에서 구입을 하였다.

세포주 및 세포배양

B16F10 melanin 세포주는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양 받아 10% fetal bovine serum (FBS)이 첨가된 Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM)을 사용하였고, Human Dermal Fibroblasts, neonatal (HDFn) 세포는 Gibco에서 구입하여 Medium 106 배지에 Low Serum Growth Supplement (LSGS)를 넣고 CO2배양기(MCO-17A1, Sanyo, Japan)에서 온도 37℃, 5% CO2조건에서 배양하였다

세포 독성 측정

B16F10와 HDFn 세포를 96well plate에 5 × 103 cells/well로 세포를 분주하여 24시간동안 세포를 안정화 시킨 뒤에 Dendrobium speciosum시료를 농도별로 처리를 하였다. 24시간 배양을 한 뒤에 MTS 용해액을 세포배양액 용액의 1/10을 첨가한 후 37℃에서 2시간 배양하였다. ELISA microplate reader (Infinite 200 pro, TECAN, Austria)를 이용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

세포내 tyrosinase activity 측정

B16F10 세포를 6well plate에 5 × 104 cells/well로 세포를 분주하여 24시간동안 세포를 안정화 시킨 뒤에 Dendrobium speciosum시료를 농도별로 0, 31.25, 62.5, 125, 250 ㎍/㎖ 처리를 하였고 1시간 뒤에 α-MSH를 100 nM이 되게 처리를 한 뒤에 72시간 동안 배양을 하였다. PBS로 2회 세척을 하고 RIPA protein lysis buffer을 처리를 한 후에 4℃에서 30분 동안 incubation을 하였다. 그 후에 4℃ 13,000 rpm 30분 원심분리를 통해 단백질이 든 상층액만을 가지고 tyrosinase activity를 측정하였다. 단백질 양을 Bradford 정량법을 통해 595 ㎚로 ELISA를 측정을 하고 동일한 단백질을 이용해서 L-DOPA를 처리를 하여 540 ㎚ 흡광도로 세포내 tyrosinase activity를 측정하였다(Jung et al., 2014).

Melanin 측정 및 관찰

B16F10 세포에 60 ㎜ 세포배양접시에 5 × 104 cells/well로 세포를 분주하여 Dendrobium speciosum추출물을 a-MSH (100 nM)보다 1시간이전에 처리를 하고 72시간동안 배양을 하였다. 그 후에 PBS로 2회 wash를 하고 Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 수확한 뒤 3000 rpm에 5분동안 세포를 모으고 상층액을 제거한 후 10% dimethylsulfoxide (DMSO)가 첨가된 1N NaOH 용액을 처리하여 80℃에서 1시간 동안 반응시켰다. melanin 정량은 합성melanin을 이용하여 ELISA microplate reader로 410 ㎚에서 각각의 흡광도를 측정하였다.

미백관련 유전자 발현 Real-time PCR

미백관련 유전자 발현을 확인하기 위해서 B16F10 세포를 60 ㎜ 세포배양접시에 1 × 105 cells/well로 세포를 분주한 후 24시간 배양한다. Dendrobium speciosum추출물을 다양한 농도로 1시간 동안 처리 한 뒤 a-MSH (100 nM)로 melanin 생성을 유도하여 24시간동안 배양을 하고 PBS로 2회 세척 후 세포를 수확하였다.

수확한 세포는 Tripure Isolation Reagent (Roche, Switzerland)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 5 ㎍의 mRNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied biosystem, USA)를 이용하여 cDNA로 합성을 하였다. 실험은 제조사 매뉴얼에 따라 수행하였다. 합성된 cDNA 1 ㎕, taqman primer 1 ㎕, Taqman Universal Master Mix II (Appiled biosystem, USA) 10 ㎕, 3차 증류수 8 ㎕를 넣고 Real-time PCR기기(ABI7500, Applied biosystem, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 정량 중합 효소 반응에 쓰인 유전자 특이적 gene의 정보는 Table 1에서 나타내었다. 또한 Real-time PCR 반응 조건은 50℃에서 2분 95℃에서 10분 동안 1회 수행하고, 변성 온도 95℃에서 15초 어닐링 온도 60℃에서 15초인 사이클을 40회 반복 수행하였다.

Table 1.Taqman gene-specific probes

Procollagen type I C-peptide 생합성 측정

Collagen 생합성량 측정은 procollagen type I C-peptide EIA kit (Takara, Japan)를 이용하여 kit 매뉴얼에 따라 실험하였다. Human Dermal Fibroblasts, neonatal (HDFn) 세포를 Medium 106 배지에 LSGS를 넣고 배양한뒤, 24 well plate에 2 × 105개로 분주하여 24시간 후에 배양액을 교환하여 석곡 시료 용액을 농도 별로 처리한 뒤 24시간 뒤에 세포배양액을 채취하여 procollagen type I C-peptide EIA kit를 이용하여 collagen 생합성량을 측정하였다. 먼저 1차 collagen 항체가 균일하게 도포된 96 well plate에 채취한 세포 배양액 20 ㎕과 2’항체 100 ㎕를 섞어 넣고, 37℃ 항온조에서 3시간 반응 시킨 뒤 PBS로 4회 세척한 다음 발색시켜 ELISA reader (Infinite 200 pro, TECAN, Austria)로 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

통계처리

본 실험에서 얻은 결과에 대해서는 평균치 ± 표준편차(mean ± S.D.)로 나타내었으며, 대조군과 각 실험군과의 평균 차이는 Student’s t-test로 분석하여 p-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.

결 과

Dendrobium speciosum 에탄올 추출물의 B16F10 세포주에 대한 세포독성평가

B16F10 세포주에서 Dendrobium speciosum 에탄올 추출물의 독성을 조사하기 위해, MTS 실험을 수행하였다. 각각 B16F10 세포에 농도별(62.5, 125, 250, 500, 1,000 ㎍/㎖)로 Dendrobium speciosum 추출물을 처리하고 24시간 후에 MTS를 처리한 결과(Fig. 1) 고농도인 500 ㎍/㎖와 1,000 ㎍/㎖에서 독성이 나타났으며, 나머지 농도에서는 독성이 없는 것으로 나타났다.

Fig. 1.Effect of Dendrobium speciosum on cell viability in melanoma (B16F10) cells. Cell viability was evaluated with the MTS assay. Data represent the mean ±S.D. of triplicate determinations from three separate experiments. (#p < 0.05 versus control).

Dendrobium speciosum 에탄올 추출물의 B16F10 세포주에 대한 melanin 합성 저해효과

Dendrobium speciosum 추출물이 B16F10 세포주에서 melanin 생합성에 미치는 영향을 확인하기 위해, Dendrobium speciosum 추출물(31.3, 62.5, 125, 250 ㎍/㎖)과 대조군인 Arbutin 100 ㎍/㎖ 을 처리한 후 1시간 뒤에 α-MSH를 처리하여 melanin 생성을 유도한 후 72시간 배양하여 전체 melanin 함량을 비교하였다. 그 결과, α-MSH를 단독으로 처리한 세포군에 비해 Dendrobium speciosum 추출물시료를 처리한 군에서 농도 의존적으로 melanin 함량이 감소되는 것을 알 수 있었다(Fig. 2). 또한 Dendrobium speciosum 추출물 시료 62.5, 125, 250 ㎍/㎖ 처리한 그룹에서는 유의성 있게 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

Fig. 2.The effect of Dendrobium speciosum on melanin contents in melanoma cells. Cells were seeded at 1 × 105 cells/well. After 24 hours, cells were treated with several concentrations of Dendrobium speciosum and α-MSH (100 nM) cultured for 72 hours. Then, melanin contents were measured as described in Materials and Methods. Data are means ± S.D. of three experiments performed in triplicate. (**p< 0.01 versus control, #p< 0.05, ##p< 0.01 versus α-MSH treatment alone).

Dendrobium speciosum 에탄올 추출물이 B16F10 세포내 tyrosinase 활성도 저해

Dendrobium speciosum 추출물이 α-MSH의해 증가된 tyrosinase 활성에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 세포 내 tyrosinase 활성도를 확인하여 보았다. 그 결과, α-MSH에 의해 tyrosinase 활성도가 증가한 것을 확인할 수 있었고 이를 Dendrobium speciosum 추출물에 의해 α-MSH에 의해 증가된 tyrosinase 활성을 낮출 수 있는 것을 확인하였다(Fig. 3). 이는 Dendrobium speciosum 추출물 시료가 tyrosinase 활성을 낮춤으로써 미백기능을 할 수 있음을 시사한다.

Fig. 3.Effect of Dendrobium speciosum and α-MSH on tyrosinase activity in melanoma cells. Cells were seeded at 1 × 105 cells/well. After 24 hours, cells were treated with several concentrations of Dendrobium speciosum, arbutin 100 ng/㎖ and α-MSH (100 nM) cultured for 72 hours. Then, tyrosinase activity were measured as described in Materials and Methods. Data are means ±S.D. of three experiments performed in triplicate. ( ** p< 0.01 versus contorl, # p< 0.05 versus α-MSH treatment alone).

Dendrobium speciosum 에탄올 추출물이 B16F10 세포주에서 melanin 합성 관련 유전자인 MITF, TYRP1, TYRP2 발현 저해

Dendrobium speciosum 에탄올 추출물이 melanin 합성 관련 유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위해 B16F10 세포주에 α-MSH와 Dendrobium speciosum 시료를 처리하여 24시간 후에 Realtime-PCR로 유전자발현을 확인하였다. 그 결과 Dendrobium speciosum 에탄올 추출물은 α-MSH에 의해 증가된 MITF, TYRP1, TYRP2의 mRNA 발현을 농도의 존적으로 저해시키는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4).

Fig. 4.Effect of Dendrobium speciosum on expression of MITF (A), TYRP-1 (B) and TYRP-2 (C) mRNA in melanoma cells. Cells were seeded at 1 × 105 cells/well. After 24 hours, cells were treated with several concentrations of Dendrobium speciosum and α-MSH (100 nM) cultured for 24 hours. Then, expression of MITF, TRP-1 and TRP-2 mRNA were measured as described in Materials and Methods. Data are means ±S.D. of three experiments performed in triplicate ( *p< 0.05 versus saline treatment, **p< 0.01 versus control, #p< 0.05 versus α-MSH treatment alone, ##p< 0.01 versus α-MSH treatment alone).

Dendrobium speciosum 에탄올 추출물이 HDFn 세포주에서 한국 자생 석곡 메탄올 추출물에 의한 Procollagen 생합성 증대

Dendrobium speciosum 시료가 인체 진피 섬유아세포의 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 대명 석곡 시료가 인체 진피 섬유아세포의 procollagen 합성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 대명 석곡시료를 독성이 없는 농도에서 처리하고 24시간 배양 후 procollagen 양을 조사하였다. 그 결과 자생 석곡 추출물은 처리하지 않은 대조군에 비하여 procollagen 합성을 농도 의존적으로 증대시켰으며, 처리한 가장 고농도인 500 ㎍/㎖ 농도에서 비처리군에 비해 procollagen 합성이 약 50% 증가하였다(Fig. 5).

Fig. 5.Effect of Dendrobium speciosum on procollagen synthesis of human dermal fibroblast. Cells were seeded at 1 × 105 cells/well. After 24 hours, cells were treated with several concentrations of Dendrobium speciosum cultured for 24 hours. Data are means ± S.D. of three experiments performed in triplicate. ( #p< 0.05 versus control).

고 찰

Melanin은 melanocyte에 의해 생성되며 피부색을 결정하는 색소이며, 자외선으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다(Yoon and Han, 2014). 하지만 과량으로 생성되어 제거되지 못하면 기미, 주근깨, 검버섯, 피부암 등의 질환과 같은 문제를 유발한다(Berneburg et al., 2000). 본 연구에서는 Dendrobium speciosum의 melanin 합성 억제 효과와 collagen 생합성 효과를 조사하여 미백기능성 및 주름개선 화장품으로써 적합한가를 조사하였다. 먼저, 세포생존능 실험 결과를 토대로 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 250 ㎍/㎖의 melanin 생성 저해 효과 및 tyrosinase 활성 역시 수행하였다. Tyrosinase는 melanin 생성 과정에 있어서 중요한 단백질로서, 이 효소는 아미노산인 tyrosine을 DOPA로 전환시키며 향후 DOPA quinone 그리고 dihydroxyindole (DHI)로 부터 DOPAchorme 거쳐 흑갈색의 melanin을 형성한다(Miyamura et al., 2006; Schiaffino et al., 2010). 본 연구에서에서는 Dendrobium speciosum 처리 시, melanin합성 및 tyrosinase의 활성이 농도 의존적으로 감소하였다. 특히, Dendrobium speciosum을 처리한 군중 에서도 62.5 ㎍/㎖ 농도에서부터 유의적으로 melanin합성 및 tyrosinase 활성이 감소되었다. 이는 Dendrobium speciosum이 tyrosinsase 활성을 저해시켜 α-msh에 유도된 melanin 합성을 억제시킨 것으로 사료된다.

Dendrobium speciosum의 melanin 합성 억제 효과를 보다 자세히 조사하기 위해 Real-time PCR을 이용하여 미백관련 유전자 발현 수준을 조사하였다. Tyrosinase 활성에 관여한다고 알려진 대표적인 전사인자는 MITF로써, α-MSH가 MC1R에 결합함으로써, GPCR-cAMP-MITF 신호전달을 통해 melanin 합성이 이루어진다(Yang et al., 2011). 이 신호전달을 통해 MITF 발현이 증가하게 되고 번역반응을 통해 단백질로 생성 되고, 이러한 MITF 단백질이 핵안으로 translocation 되어 전사인자로서 melanin 합성과 관련된 key 효소인 tyrosinase, TYRP1, TYRP2의 유전자 발현을 증가시키게 된다(Liu and Fisher, 2010; Kim et al., 2011). Dendrobium speciosum 에탄올 추출물은 이러한 key효소들의 발현을 억제하는 것을 확인할 수 있었고, Dendrobium speciosum 에탄올 추출물이 MITF와 관련된 신호 전달을 억제하여 melanin 합성 관련물질들인 Tyrosinae, TYRP1, TYRP2를 저해하여 최종적으로 melanin 생합성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

Collagen은 피부를 구성하는 진피층을 구성하고 있는 주요 구조 단백질로 피부, 골, 인대, 연골 및 치아 등에 높은 농도로 존재하고 있으며, 섬유아세포에서 세포외기질을 구성하는 중요한 구성요소이다(Yoo et al., 2010). 특히, collagen은 수분 균형을 유지하고, 자외선과 같은 외부자극으로부터 피부 손상을 막아주는 역할을 하여 주름 예방 및 탄련적인 피부를 유지하는데 밀접한 연관이 있으며, 이러한 collagen의 감소는 피부노화 및 주름생성의 원인으로 작용한다(Yang et al., 2013). 그러므로 collagen 합성을 촉진하는 소재의 발견은 화장품 원료로서의 이용이 매우 크다고 볼 수 있다.

Procollagen은 collagen의 전구체로서 propeptide라 불리는 peptide sequence를 가지고 있다. Propeptide는 소포체내에서 collagne 생성을 관여하며 동시에 collagen 분자로부터 분리 된다(Dumont et al., 2010). 따라서, collagen 생합성의 양은 propeptide의 양을 측정함으로써 그 생합성 효과를 유추할 수 있다. Fig. 5의 결과처럼 대명 석곡은 농도 의존적으로 procollagen 합성을 유도하는 것으로 나타났으며, 이에따라 Dendrobium speciosum는 주름개선에 효과가 있을것으로 사료된다.

위 연구결과들을 토대로 Dendrobium speciosum 에탄올추출물은 효과적인 미백 및 주름개선 기능성 화장품 소재로 사용 가능할 것으로 보이며, 효율적인 추출법, 전임상 동물실험 그리고 유효성분의 개발과정이 수반되어야 한다고 사료된다.