서 론

한천(agar)은 홍조류에서 추출한 친수 콜로이드로 바다에 서식하는 대형 홍조류인 우뭇가사리, 해지누아리, 석무 및 꼬시래기 등의 주요 세포벽 구조성분이다[2, 5, 7, 21]. 한천은 agarose와 agaropectin으로 구성되어 있으며, agarose는 1→3 결합으로 연결된 β-D-galactopyranose와 1→4 결합으로 연결된 3,6-anhydro-α-L-galactose가 교대로 결합된 중합체이다. Agaropection에는 agarose와 달리 sulfoxy, methoxy 및 pyruvate 잔기 등에 의해서 수식된 3,6-anhydro-α-L-galactose가 존재한다[22, 23].

한천분해효소인 agarase에 의한 분해생성물인 한천올리고당은 생리활성이 높아 화장품, 의약품 및 건강기능성식품에 널리 사용되고 있으며, 당뇨병, 난소화성, 비만, 변비 등의 예방과 치료에도 효과가 있다고 알려져 있다[6, 10, 12, 21]. 고부가가치 소재로서의 활용 가능성이 높은 한천올리고당을 생산하기 위한 방법으로는 산가수분해법과 한천분해효소(agarase)를 이용하는 효소적 가수분해법이 있는데[8], 산가수분해법은 무작위로 한천을 분해하므로, 한천올리고당의 기능성 및 안정성이 확보되기 어렵고, 효소적 가수분해법은 선택적으로 한천을 분해하므로 활성형 올리고당을 생산하는데 유용한 것으로 알려져 왔다[10]. 한천분해효소는 한천의 α-1, 3 결합을 끊어 agarooligosaccharides를 생산하는 α-agarase와 β-1, 4 결합을 끊어 neoagarooligosaccharides를 생산하는 β-agarase로 나뉜다. α-agarase가 생산하는 agarooligosaccharides는 항산화 효과와 항암 활성을 가지고 있으며, β-agarase가 생산하는 neoagarooligosaccharides는 세균성장 억제, 전분노화 방지, 대식세포 활성화, 보습효과 및 미백효과를 가지므로, 의약품, 건강기능식품 등에 이용될 수 있다[3, 7, 12].

따라서 고기능성인 한천분해산물의 생산을 위해 한천분해효소를 생산하는 균주에 대한 연구들이 많이 이루어지고 있으며 특히 β-agarase에 관한 연구가 최근까지 많이 보고되고 있다. 지금까지 보고된 균주로는 Cellvibrio 속[3], Alteromonas 속[4], Microbulbifer 속[11], Pseudoalteromonas 속[14, 20], Flammeovirga 속[8], Glaciecola 속[17], Thalassomonas 속[16], Neiella 속[18] 등이 있으며, 이 균주들이 생산하는 β-agarase의 효소학적 특성규명이 두드러지게 연구되고 있는 상태이다.

한편, 기질이 고체보다는 액체상태 그리고 gel 상태보다는 sol 상태일 때 효소에 의한 반응이 원활히 일어난다. 한천은 45℃ 이상의 온도에서 sol 상태에 있다[8]. 따라서 45℃ 이상의 고온에서 활성이 있는 한천분해효소를 생산하는 균주를 탐색하는 것은 중요하다.

본 연구에서는 45℃ 이상의 온도에서 활성이 우수한 한천분해효소를 생산하는 미생물을 분리하기 위하여 국내 연안의 해수로부터 한천 분해 세균을 분리하고 동정하였으며 이 세균이 생산하는 한천분해효소의 생화학적 특성을 조사하였고 산업적 적용가능성이 높을 것으로 판단하였다.

재료 및 방법

한천분해 균주의 분리 및 동정

경상남도 남해군 미조면 연안에서 한천분해활성을 가지는 세균의 분리를 위한 시료를 채취하였으며, Marine broth 2216 (Difco, USA) 배지에 한천을 첨가한 Marine agar 2216 배지에 시료액을 도말한 후 30℃에서 배양하면서 한천분해활성으로 Marine agar 2216 배지를 함몰시키는 SH-1 균주를 3차례 이상 순수분리하여 선별하였다. 순수분리된 균체로부터 Wizard Genomic DNA Isolation Kit (Promega, WI, USA)를 사용하여 genomic DNA를 획득하고, 16S rDNA 유전자 단편을 증폭하기 위한 PCR 반응의 주형으로 사용하였다. PCR primer로는 27F (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 1492R (5'-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였으며, 증폭된 DNA 단편은 PCR/Gel Combo Kit (NucleoGen, Korea)로 정제하였다. DNA 염기서열 분석은 Cosmo Genetech (Korea)에서 수행하였다. 분석된 염기서열은 BLAST를 사용하여 보고된 균주들과 유사도를 검토하였으며, Clustal 프로그램(ClustalW2)을 이용하여 다중염기배열(multiple alignment)을 수행한 후 Neighbor-joining method와 Bootstrap method (n = 1,000)로 분석하여 계통분류학적 위치를 파악하였다.

한천분해 균주의 배양

Marine broth 2216 배지 4 ml에 순수분리한 SH-1 균주를 접종한 후 진탕배양기를 이용하여 30℃, 250 rpm에서 하룻동안 진탕배양한 후, 0.2% (w/v)의 agar가 첨가된 Marine broth 2216 배지 50 ml가 들어있는 삼각플라스크에서 진탕배양기를 이용하여 30℃, 250 rpm에서 3일 동안 진탕배양하였다.

배양시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 효소활성 측정

Marine broth 2216 배지 100 ml에 0.2% (w/v)의 agar를 첨가한 후 SH-1 균주를 접종하여 30℃, 250 rpm에서 진탕배양하였고, 12시간마다 일부 배양액을 수득하여 시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 효소의 활성을 측정하였다.

조효소액의 제조

배양액을 원심분리하여(3,000 ×g, 4℃, 15 min) 균체를 제거한 후 얻어진 상층액 15 ml를 Snake Skin Dialysis Tubing (Thermo Scientific, USA)에 넣고 l L 비커에 20 mM Tris-HCl (pH 7.0)를 900 ml 첨가하고, 4℃인 냉장실에서 2시간마다 20 mM Tris-HCl (pH 7.0)를 갈아주는 것을 2번 반복한 후 3번째에는 12시간 이상 투석을 시행하였다. 투석이 완료된 조효소액은 membrane filter (0.45 μm, Milipore, USA)를 통과시킨 후에 4℃에서 냉장 보관하였다.

효소활성 측정

Agarase 활성은 DNS법을 이용하여 측정하였다. DNS법은 3,5-dinitrosalicylic acid method의 변형법[4]으로 환원당을 측정하는 방법이다. DNS solution은 NaOH 13.2 g, 3,6-dinitrosalicylic acid 7.07 g, sodium sulfate 5.53 g, potassium tartrate (Rochelle salt) 204 g, phenol 5.07 g을 증류수 1L에 녹여서 제조하였다. 1 ml의 효소 반응액에 3 ml의 DNS solution을 첨가하여 100℃에서 10분간 가열한 후 550 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준적정곡선으로 D-galactose를 사용하였다. 한천분해 효소의 활성은 1분당 1 μM의 galactose를 생산하는 한천분해 효소의 양을 1 unit(U)으로 나타내었다.

pH에 따른 한천분해 효소의 활성측정

pH에 따른 한천분해 효소의 활성을 측정하기 위하여 20 mM sodium acetate 완충용액(pH 4.0−5.0), 20 mM Tris-HCl 완충용액(pH 5.0−8.0), 20 mM GTA (3,3-dimethyl-glutamic acid, Tris (hydroxymethyl)-aminomethane, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol) 완충용액(pH 8.0−9.0)을 이용하였다. 0.2% (w/v)의 agarose가 포함된 모든 완충용액을 중탕 가열한 후 40℃를 유지하면서 완충용액 1 ml에 조효소액 0.5 ml을 첨가하여 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다.

반응온도에 따른 한천분해 효소의 활성측정

조효소액을 이용하여 온도에 따른 한천분해효소의 활성을 비교하였다. 표준 기질용액으로는 0.2% (w/v)의 agarose가 포함된 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) 완충용액을 이용하였다. 기질용액을 중탕 가열한 후 20−70℃의 온도별로 냉각하였다. 기질용액 1.0 ml에 조효소액 0.5 ml를 첨가하여 각 온도에서 30분간 반응시킨 후 효소활성을 측정하였다.

한천분해 효소의 열안정성 측정

조효소액을 이용하여 온도에 따른 한천분해효소의 활성을 비교하였다. 표준 기질용액으로는 0.2% (w/v)의 agarose가 포함된 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) 완충용액을 이용하였다. 조효소액 0.5 ml를 첨가하여 각 온도별로 30분 열처리한 후, 기질용액 1.0 ml를 첨가하여 30분간 반응시켰다. 측정된 효소활성은 열처리전의 효소활성과 비교하였다.

한천가수분해산물의 thin-layer chromatography (TLC) 분석

효소액을 이용한 agarose의 분해산물을 TLC로 분석하였다. 조효소액과 0.2% (w/v)의 agarose가 포함된 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) 완충용액을 50℃에서 0, 0.25, 0.5, 1.5, 6, 13시간 반응시킨 후, Silica Gel 60 TLC Plate (Merck, Germany)로 분석을 수행하였다. n-Butanol/acetic acid/H2O (2/1/1 (v/v/v))를 이용하여 전개시켰고, 10% (v/v) H2SO4로 가시화시켰다. 표준물질로는 D-galactose (Sigma) 및 neoagarooligosaccharides [15]를 사용하였다. TLC에서 나타난 가수분해산물의 농도를 계산하기 위하여 Image J 1.44 (Wayne Rasband, USA)를 이용하여 측정하였다.

결과 및 고찰

한천분해균주의 분리 및 동정

경상남도 남해군 미조면 연안의 해수 시료를 Marine agar 2216 배지에 도말하여 한천 분해능이 우수한 균주를 선별하였다. 함몰이 일어난 부위의 균을 멸균된 백금이를 이용하여 Marine agar 2216 배지에 3차례 이상 streaking하여 균주를 순수분리하였다. 분리된 한천분해능 SH-1 균주의 16S rDNA 염기서열 분석결과 1,465 bp의 염기서열을 얻었고, BLAST 탐색으로 Maribacter sp. KMM 6377 및 Maribacter sp. w-11-2와 99%의 가장 높은 상동성을 나타냈으므로, 분리균주를 Maribacter sp. SH-1으로 명명하였다. 본 연구와 Genbank에서 획득한 16S rDNA 염기서열을 Neighbor-joining method와 Bootstrap method (n = 1,000)로 분석하여 나타난 본 연구 균주의 계통분류학적 위치를 Fig. 1에 나타냈다.

Fig. 1.Phylogenetic tree based on almost complete 16S rDNA sequence comparing isolated Maribacter sp. SH-1 strain with other bacteria. The numbers at the branch node are percentages of bootstrap values (n= 1,000) and numbers in parenthesis are numbers in GenBank.

시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 효소활성 측정

Marine broth 2216 배지 100 ml에 0.2% (w/v)의 agar를 첨가한 후 SH-1 균주를 접종하여 30℃, 250 rpm에서 진탕배양하였을 때 나타나는 생육양상과 효소활성을 Fig. 2에 나타냈다. 시간에 따른 한천분해 균주의 생육과 효소활성의 측정결과를 살펴보면, 72시간까지 균의 수가 증가하는 대수기로 나타났으며, 이 후 성장이 지체되었다. 배양 시간에 따른 배양액으로 외분비된 agarase의 활성도를 측정한 결과, 배양 12시간 이후부터 균 증식속도와 비례적으로 활성도가 증가하며 배양 72시간까지 최대의 활성을 보여 주었다. Maribacter sp. SH-1 균주의 한천분해효소는 성장의존성 산물로 확인되었고, 이후의 연구에서는 72시간까지 진탕배양하여 생성된 효소액을 활성 측정에 이용하였다.

Fig. 2.Cell growth and agarase activity of Maribacter sp. SH-1. (■ agarase activity [units/l], □ cell growth [OD600]).

pH에 따른 한천분해효소의 활성

각 pH에서의 한천분해효소의 활성을 Fig. 3에 나타냈다. 사용한 완충용액과 pH 중 최고의 활성을 나타내는 것은 pH 6.0의 20 mM Tris-HCl 완충용액으로 나타났다. 또한, 20 mM Tris-HCl 완충용액으로 활성을 측정하였을 때 pH 7.0에서 한천분해 상대활성이 pH 6.0에서의 최고활성에 비해 60% 이상이었다. 균주에 따른 한천분해효소의 활성에 있어서의 최적 pH는 Pseudoalteromonas sp. CY-24의 경우 pH 6.5이었고[20], Microbulbifer sp. SD-1의 경우 pH 6.0이었으며[11], Bacillus cereus ASK202의 경우 pH 7.8 [6], Agarivorans albus YKW-34 [5], Glaciecola sp. SL-12 [17]와 Thalassomonas sp. SL-5 [16] 및 Sphingomonas paucimobili AS-1 [10], 해양성 SH-1 균주[18]와 Alteromonas macleodii subsp. GNUM08120 [4]의 경우는 모두 pH 7.0으로 균주에 따른 한천분해효소의 다양한 최적 pH가 보고되어 있다.

Fig. 3.Effect of pH on agarase activity. (■ 20 mM sodium acetate, pH 4.0−5.0; Δ 20 mM Tris-HCl, pH 5.0−8.0; ● 20 mM GTA, pH 8.0−9.0). The reactions were carried out at 30℃ in 1 ml of corresponding buffer containing 0.2% agar and 0.5 ml of enzyme solution for 30 min. The values obtained at pH 6.0 were taken to be 100%. All data shown are mean values from at least three replicate experiments.

온도에 따른 한천분해효소의 활성

최적 pH인 pH 6.0의 20 mM Tris-HCl 완충용액을 사용하였을 때 각 온도에서의 한천분해효소의 활성을 Fig. 4에 나타냈다. 본 효소는 50℃에서 최고활성을 보였으며 배양액에서 구한 활성은 231 U/l로 나타났다. 가장 높은 활성을 나타낸 50℃의 반응온도에서 나타난 효소활성을 100%로 하였을때, 40℃에서 94%, 30℃에서 62%의 상대활성을 갖는 것으로 나타났다(Fig. 4). 이러한 결과로 Maribacter sp. SH-1가 생산하는 한천분해효소는 비교적 높은 온도인 50℃에서 가장 활성이 높았다. 균주에 따른 한천분해효소의 온도별 최적활성은 Glaciecola sp. SL-12 [17], Agarivorans albus YKW-34 [5]와 Microbulbifer sp. SD-1 [11]는 30℃에서, 해양성 SH-1 균주[18], A. macleodii subsp. GNUM08120 [4], Pseudoalteromonas sp. CY-24 [20], Thalassomonas sp. SL-5 [16]와 Sphingomonas paucimobili AS-1 [10]는 40℃에서 나타났는데, 본 연구에서 분리한 Maribacter sp. SH-1 균주 유래의 한천분해효소는 이들보다는 5−15℃ 정도 높은 온도에서 최적활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 고체한천을 가열하여 녹인 한천용액은 45℃ 이하의 온도에서는 gel이 되는데[8], Bannikova 등[1]은 고온성세균인 Thermoanaerobacter와 Caldoanaerobacter 속 세균이 50℃ 이상에서 한천분해활성이 우수한 효소를 생산한다고 보고하였다. 하지만 이들은 혐기성세균으로 다량의 효소를 혐기적으로 생산하는데 어려움이 있으며 한천분해유전자의 재조합 발현에 대한 보고도 아직 없다. 한편 무작위 돌연변이(random mutagenesis)와 부위특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis)를 통해 한천분해효소의 최적온도와 열안정성을 상승시킨 보고도 있었다[9, 19].

Fig. 4.Effect of reaction temperature on agarase activity. The reactions were carried out at 20, 30, 40, 50, 60 and 70℃ in 1 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) buffer containing 0.2% agar and 0.5 ml of enzyme solution for 30 min. The values obtained at 50℃ were taken to be 100%. The relative activities are the averages from three independent experiments.

본 연구의 Maribacter sp. SH-1 유래의 한천분해효소는 45℃ 이상의 온도에서도 높은 활성을 나타내므로 기질인 한천이 sol 상태의 조건에서 분해반응을 수행할 수 있어 보다 효율적인 한천분해공정의 개발이 가능할 것으로 기대된다. 또한, 한천분해활성의 강도에 있어서도 Maribacter sp. SH-1 유래 한천분해효소의 최고활성이 231 U/l로 Thalassomonas sp. SL-5 [16]의 363 U/l보다는 낮지만 Glaciecola sp. SL-12 [17]의 233 U/l와 비슷한 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

한천분해효소의 열안정성

Maribacter sp. SH-1 유래 한천분해효소의 열안정성을 Fig. 5에 나타냈다. 20, 30, 40℃에서는 30분의 열처리를 하여도 열처리하지 않은 효소에 비해 90% 이상의 상대활성을 유지하였지만 50℃에서는 30분간 열처리를 하였을 때 열처리하지 않은 효소 활성에 비해 50% 이상의 상대활성을 보였다. 돌연변이법을 통해 열안정성을 향상시킨다면 산업적 활용가치를 더욱 높일 수 있을 것이다[9, 19].

Fig. 5.Heat stability of agarase activity. The enzyme solutions were pre-incubated at 20, 30, 40, 50, 60 and 70℃ for 0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 h. The reactions were then carried out at 50℃ in 1 ml of 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) buffer containing 0.2% agar and 0.5 ml of heat-treated enzyme solution for 30 min. The agarase activities were remained over 90% at 20, 30 and 40℃ after 0.5 h exposure at that temperatures.

한천가수분해산물의 TLC 분석

Maribacter sp. SH-1 균주를 3일간 배양하여 제조된 조효소액에 0.2% (w/v)의 agarose를 기질로 첨가하여 시간별로 반응시킨 후 TLC로 분석한 결과를 Fig. 6에 나타냈다. 한천 혹은 agarose를 기질로 사용하면 β-agarase는 neoagarohexaose, neoagarotetraose 및 neoagarobiose 등의 neoagarooligosaccharides를 생성할 수 있으며, α-agarase는 agaropentose 및 agarotriose등의 agarooligosaccharides를 생성할 수 있다[7]. Maribacter sp. SH-1 균주가 생산하는 한천분해효소의 가수분해산물을 TLC로 분석한 결과, 주로 neoagarotetraose (NA4) 및 neoagarohexaose (NA6)를 생산하고, neoagarobiose (NA2)도 일부 생산하는 것으로 나타났다. 시간에 따른 가수분해산물의 농도를 측정한 결과, 0.25시간의 반응에서 이미 NA2, NA4, NA6 등의 산물이 형성되었고 6시간째에 NA6 이상의 산물이 줄어드는 것으로 나타났지만 13시간째를 보면 다시 NA6 이상의 산물이 증가하였다(Fig. 6). 각 시간에서 생산된 가수분해산물의 합을 100%로 하여 NA2, NA4 등의 상대비율을 보면 가수분해산물은 비슷한 비율로 농도가 유지되었으며, 평균적으로 neoagrotetraose (52.2%) neoagrohexaose (34.8%), 및 neoagarobiose (13.0%) 순으로 생산되었다. 따라서, Maribacter sp. SH-1 균주의 한천분해효소는 일정한 비율로 neoagarooligosaccharides에 속하는 neoagarobiose, neoagarotetraose 및 neoagarohexaose를 생산하는 것으로 보아 본 효소가 β-agarase임을 알 수 있었다[18]. 본 연구의 결과들로 파악하면 Maribacter sp. SH-1 균주와 한천분해효소를 이용하여 보습 및 미백효과, 세균성장 억제, 전분노화방지 및 대식세포 활성화 기능을 가진 소재의 개발과 이용이 가능할 것으로 판단된다[13, 15].

Fig. 6.TLC analysis of the hydrolyzed products of agarose by agarase. The reactions were carried out at 50℃ in 20 mM Tris-HCl (pH 6.0) buffer containing 0.2% agar and 0.5 ml of enzyme solution for 0, 0.25, 0.5, 1.5, 6 and 13 h. The reaction mixtures were developed by TLC. (G, D-galactose; NA, neoagarooligosaccharides; NA2, neoagarobiose; NA4, neoagarotetraose; NA6, neoagarohexaose).